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May 23, 2023

Identification de l'âge

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2836 (2023) Citer cet article

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L'un des événements clés de l'encéphalite virale est la capacité du virus à pénétrer dans le système nerveux central (SNC). Plusieurs virus encéphalitiques, dont le virus La Crosse (LACV), induisent principalement une encéphalite chez les enfants, mais pas chez les adultes. Ce phénomène est également observé dans les modèles de souris LACV, où le virus accède au SNC des animaux sevrés par fuite vasculaire des microvaisseaux cérébraux, probablement par les cellules endothéliales capillaires cérébrales (BCEC). Pour examiner les facteurs de régulation de la fuite vasculaire spécifiques à l'âge et à la région, nous avons utilisé la transcriptomique à l'échelle du génome et le dépistage ciblé des siARN pour identifier les gènes dont la suppression affectait la pathogenèse virale dans les BCEC. Une analyse plus approfondie de deux de ces produits géniques, Connexin43 (Cx43/Gja1) et EphrinA2 (Efna2), a montré un effet substantiel sur la pathogenèse du LACV. L'induction de Cx43 par l'acide 4-phénylbutyrique (4-PBA) a inhibé la maladie neurologique chez les souris sevrées, tandis que le déficit en Efna2 a augmenté la maladie chez les souris adultes. Ainsi, nous montrons que Efna2 et Cx43 exprimés par les BCEC sont des médiateurs clés de la neuroinvasion induite par le LACV et des maladies neurologiques.

Le virus La Crosse (LACV), un virus à ARN de sens négatif appartenant à la famille des bunyaviridae1, est l'une des principales causes d'encéphalite arbovirale chez les enfants2. Chez l'adulte, l'infection par le LACV provoque généralement un syndrome fébrile très léger3. L'incidence plus élevée de maladies neurologiques chez les enfants par rapport aux adultes suggère des différences liées à l'âge qui peuvent être responsables de la capacité du virus à accéder au système nerveux central (SNC) et/ou à causer des dommages au sein du SNC. La compréhension de ces différences pourrait fournir des pistes pour la prévention ou le traitement de l'encéphalite à LACV.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une barrière sélectivement perméable qui joue un rôle important dans l'inhibition de l'accès des agents pathogènes au SNC. La barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​est composée principalement de cellules endothéliales capillaires cérébrales (BCEC) avec des astrocytes, une membrane basale et des péricytes voisins, qui interagissent avec les neurones et la microglie environnants pour former l'unité neurovasculaire4. La perméabilité sélective à travers les BCEC est définie par plusieurs protéines de transport et de transport ainsi que la jonction serrée (TJ), la jonction adhérente (AJ) et la jonction lacunaire (GJ) (collectivement protéines de jonction cellulaire (CJ)))5,6. L'intégrité de la BBB est renforcée au cours du développement7,8. Elle atteint son apogée à l'âge adulte, puis s'affaiblit progressivement avec l'âge en raison de l'expression réduite de la protéine CJ et de l'altération fonctionnelle des transporteurs9,10.

La pathologie observée à partir de l'encéphalite LACV indique une dégradation substantielle de la BHE. L'analyse immunohistochimique (IHC) des biopsies cérébrales de patients LACV montre un brassard mononucléaire périvasculaire avec des agrégats focaux de cellules immunitaires11, et d'autres études ont démontré des lésions vasculaires induites par l'encéphalite LACV12. Ainsi, l'encéphalite LACV est étroitement associée à une pathologie et à des anomalies neurovasculaires.

Une encéphalite LACV et une pathologie vasculaire similairement dépendantes de l'âge sont observées dans le modèle de souris C57BL/6. Les souris sevrées (âgées d'environ 3 semaines) sont très sensibles à l'infection LACV du SNC et développent une maladie clinique à la suite d'une infection périphérique (intrapéritonéale, IP) ou directe du SNC (intracérébrale, IC). En revanche, les souris adultes âgées de ≥ 6 semaines sont résistantes à l'infection périphérique (IP) mais sont sensibles à l'infection directe du SNC (IC)13,14,15. Ainsi, il existe une nette différence liée à l'âge dans la capacité du LACV à accéder au SNC après une infection périphérique.

Des études sur la susceptibilité liée à l'âge montrent une augmentation des fuites vasculaires et une dégradation de la BHE chez les jeunes souris après une infection par le LACV. Bien que les BCEC infectés par le LACV ne soient pas facilement observés in vivo, la dégradation de la BHE est médiée par une fuite spécifiquement à travers les microvaisseaux/BCEC dans la région du bulbe olfactif (OB)/noyau olfactif antérieur (AON), mais pas ceux du cortex (CT ) région16. La fuite virale culmine généralement à 3 jours post-infection (dpi) et une infection virale des neurones est observée dans les régions associées à cette fuite vasculaire. Dans une étude précédente, nous avons démontré qu'une réponse spécifique à l'âge des microvaisseaux cérébraux / BCEC provoque des effets cytopathiques différentiels et une sensibilité au LACV. De plus, en utilisant des fragments de microvaisseaux cérébraux isolés ex vivo et des cultures in vitro de BCEC primaires isolés de souris sevrées et adultes, nous avons montré que les BCEC sevrés sont plus sujets à l'infection par le LACV, à la formation d'agrégats de type syncytia et à la mort des cellules témoins17. Les réponses BCEC peuvent être contrôlées par plusieurs facteurs, notamment la réponse immunitaire de l'hôte, la survie cellulaire, l'expression de protéines CJ fonctionnelles, le maintien des vaisseaux sanguins ou par des interactions multigéniques. L'identification des facteurs qui diffèrent entre les microvaisseaux cérébraux / BCEC sevrés et adultes au cours de l'infection par le LACV peut fournir des informations sur les facteurs essentiels à la prévention de la neuroinvasion du LACV.

Nous avons émis l'hypothèse que des facteurs de restriction putatifs pourraient être présents ou renforcés chez les souris adultes résistantes au LACV, tandis que des facteurs de susceptibilité putatifs pourraient prédominer chez les souris sevrées sensibles au LACV. Pour identifier ces facteurs, nous avons d'abord utilisé l'analyse du transcriptome basée sur le séquençage de l'ARN (ARN-seq) dans des fragments de microvaisseaux cérébraux isolés ex vivo obtenus à partir de souris sevrées et adultes et évalué les réponses à l'acide polyinosinique : polycytidylique (poly I: C) pour imiter les virus induits par le virus. immunostimulation. Nous avons en outre comparé les profils d'ARN-seq dans des fragments de microvaisseaux cérébraux isolés de la région OB et CT de souris sevrées infectées par LACV ou inoculées par simulation. Les gènes candidats présentant des profils d'expression différentiels à partir de ces analyses ont été soumis à un criblage ciblé de petits ARN interférents (ARNsi) pour identifier les régulateurs putatifs de la sensibilité au LACV dépendant de l'âge. Les gènes touchés ont été évalués pour leur site d'implication potentielle dans la voie infectieuse du LACV, et deux gènes, la protéine de jonction lacunaire alpha 1 (Gja1) et l'éphrineA2 (Efna2) ont été identifiés comme des cibles thérapeutiques potentielles pour contrôler les fuites vasculaires induites par le LACV et l'établissement de neuro-infection.

Nous avons d'abord cherché à identifier les régulateurs de gènes candidats qui contribuent à la sensibilité au LACV en fonction de l'âge. Des souris sevrées (W) et adultes (A) ont été traitées soit avec du poly I:C (PI) pendant 3 h (en tant que substitut d'un stimulus d'ARN viral) soit avec un véhicule témoin (V). Des fragments de microvaisseaux cérébraux entiers isolés de ces souris ont été soumis à une analyse ARN-seq pour identifier les gènes intrinsèquement dépendants de l'âge ou induits par la stimulation Poly I: C (Fig. 1a). L'expression génique a été comparée pour les différences liées à l'âge au niveau basal en comparant les groupes de véhicules sevrés (WV) aux groupes de véhicules adultes (AV). Les comparaisons d'activation ont été effectuées en comparant le sevrage poly I:C stimulé (WPI) à WV, l'adulte poly I:C stimulé (API) à AV ainsi que WPI à API. Les diagrammes volcaniques d'expression génique différentielle et les analyses d'enrichissement des voies (Ingenuity Pathway Analysis, IPA), à partir des comparaisons ci-dessus, mettent en évidence les processus cellulaires qui distinguent les différents groupes de traitement et d'âge (Fig. 1a – d supplémentaires). Des gènes spécifiques pour une évaluation plus approfondie ont été sélectionnés sur la base de l'expression différentielle entre les groupes avec une différence log2 ≥ 1, p <0, 05 et une moyenne de base ≥ 100 (tableau supplémentaire 1, groupe 1). Pour évaluer la composition cellulaire probable dans les fragments de microvaisseaux isolés, nous avons évalué l'expression de gènes spécifiques au type de cellule à partir des données d'ARN seq (tableau supplémentaire 2). Cela a montré que les gènes spécifiques de BCEC étaient fortement enrichis, qu'il y avait une expression modérée/faible de marqueurs de péricytes, mais très peu d'expression de gènes caractéristiques des astrocytes, des neurones et des cellules musculaires lisses. Cela a confirmé que la méthode utilisée pour la préparation des fragments de microvaisseaux a entraîné un enrichissement en BCEC hautement spécifique, comme décrit précédemment18,19,20.

une approche séquentielle pour sélectionner des gènes cibles à partir d'analyses d'ARN-seq sur des souris sevrées (W) ou adultes (A) traitées par véhicule (V) ou Poly I:C (PI) ou adultes (A) (WV, WPI, AV et API). b Identification de gènes cibles à partir d'analyses ARN-seq de fragments de microvaisseaux des régions du bulbe olfactif (OB) et du cortex (CT) de souris sevrées infectées par le LACV (LOB et LCT) et de souris inoculées simulées (MOB et MCT) (N = 3 pour tous les ARN -seq échantillons). La fonction DESeq par défaut avec betaPrior = FALSE a été appliquée, dans laquelle un modèle généralisé binomial négatif avec test de Wald pour la signification a été réalisé. Les valeurs p bilatérales ont été corrigées pour les tests multiples à l'aide de la méthode Benjamini Hochberg. c – e Expression différentielle de gènes représentatifs, validée par des analyses PCR en temps réel sur des fragments de microvaisseaux isolés ex vivo provenant de souris infectées sevrées simulées (WM), sevrées LACV (WL), adultes simulées (AM) et adultes LACV (AL). Catégories de gènes : (c) intrinsèque spécifique à l'adulte (pour Efna2 et H2q6 MW vs AM P = 0,0032 et P = 0,0001 et WL vs AL P = 0,0002 et P = 0,0356), d intrinsèque spécifique au sevrage (pour Bst1 et Mmp25 MW vs AM P < 0,0001 et P = 0,1010 et WL vs AL P < 0,0001 et P = 0,4684) ou (e) Infection par le LACV, gènes améliorés adultes (pour Clec4e et Cldn1 WM vs AM P = 0,0453 et P = 0,0894 et WL vs AL 0,6490 et P = 0,5686). f Expression différentielle de gènes représentatifs de fragments de microvaisseaux OB et CT obtenus à partir d'adultes infectés par LACV (AOB et ACT) et de sevrés (WOB et WCT). P = 0,0043 et P = 0,0068 pour Aqp1 et Ttr pour la comparaison WOB vs WCT et P = 0,0417 et P < < 0,0001 pour Aqp1 et Ttr pour la comparaison AOB vs ACT. Les données en (c – f) ont été transformées à l'échelle log2 pour une distribution plus normale et les points de données ont été analysés statistiquement ou tracés après la transformation. Les valeurs de signification ont été mesurées par une ANOVA unidirectionnelle suivie d'une comparaison multiple de Tukey (c–e) ou de tests t bilatéraux multiples non appariés (f) (N = 5–6 pour toutes les expériences sur souris, du panel c–f et individuel points de données sont affichés). (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001).

Comme des différences régionales dans l'intégrité de la BBB sont observées après l'infection par le LACV et que l'infection virale est d'abord observée dans la région OB chez les souris sevrées16, nous avons également effectué une analyse ARN-seq sur des fragments de microvaisseaux isolés de différentes régions infectées par le LACV (L) et simulées. cerveaux de souris sevrés inoculés (M) à 3 dpi. Les gènes de cette comparaison ont été sélectionnés sur la base de deux critères d'expression génique différentiels : soit une différence d'expression entre les fragments de microvaisseaux de l'OB de souris infectées par le LACV (LOB) par rapport à l'OB de souris infectées fictives (MOB), soit une différence de gène expression entre LOB et fragments de microvaisseaux de CT de souris infectées par LACV (LCT) (Fig. 1b). Ces critères ont été utilisés pour sélectionner des gènes supplémentaires pour une analyse plus approfondie (tableau supplémentaire 1, groupe 2). L'expression différentielle des gènes et les analyses IPA de ces comparaisons mettent en évidence l'enrichissement attendu de l'interféron et de la neuroinflammation après l'infection par le LACV de l'OB, ainsi que les différences de signalisation de Gap Junction et d'Ephrin dans la comparaison OB / CT (Fig. 1e, f supplémentaires). Enfin, en plus des gènes sélectionnés des groupes 1 et 2, nous avons également inclus des gènes connus pour affecter la fonction BBB et la réponse immunitaire de l'hôte au LACV, mais pas nécessairement différenciés dans l'analyse ci-dessus de la séquence d'ARN (tableau supplémentaire 1, groupes 3 et 4, respectivement).

Pour confirmer davantage les différences d'expression des gènes sélectionnés, nous avons analysé l'expression par qPCR après infection par LACV. Les ARN ont été extraits de fragments de microvaisseaux obtenus à partir de souris adultes (AL) ou sevrées (WL) infectées par LACV à 3 dpi ainsi que de souris sevrées (WM) et adultes (AM) inoculées par simulation, tandis que des fragments de microvaisseaux supplémentaires ont été extraits de OB et Régions CT de souris sevrées et adultes infectées par LACV (3 dpi). Des analyses PCR en temps réel sur des fragments de microvaisseaux isolés ex vivo ont montré que les gènes se répartissaient en quatre catégories principales, améliorés par l'adulte, améliorés par le sevrage, induits par le LACV et spécifiques à la région (OB-CT) (Fig. 1c – f). Par exemple, ephrinA2 (Efna2; une molécule angiogénique) et H2q6 (appartenant à la famille du CMH de classe I) étaient exprimés à des niveaux plus élevés dans les fragments de microvaisseaux adultes, quelle que soit l'infection virale (Fig. 1c). L'antigène 1 des cellules stromales de la moelle osseuse (Bst1; un régulateur immunitaire) et la métallopeptidase matricielle 25 (Mmp25) avaient des niveaux de base plus élevés chez les souris sevrées (Fig. 1d). La famille 4 du domaine de lectine de type C, le membre e (Clec4e ; une molécule qui reconnaît LACV et joue un rôle limité dans les réponses antivirales précoces contre LACV21) et la claudine 1 (Cldn1 ; une protéine TJ présente dans les cellules endothéliales/épithéliales) ont été augmentés par LACV infection chez les souris adultes, mais pas chez les souris sevrées (Fig. 1e). Seuls quelques gènes ont été différentiellement exprimés entre les fragments de microvaisseaux OB et CT. Parmi ceux-ci, deux gènes de maintien de l'homéostasie, l'aquaporine 1 (Aqp1 ; un transporteur passif) et la transthyrétine (Ttr ; une protéine porteuse) ont été augmentés dans les fragments de microvaisseaux CT de souris sevrées (WCT) et adultes (ACT) par rapport aux fragments de microvaisseaux OB obtenus à partir de souris sevrées (WOB) et adultes (AOB). La comparaison par paires entre les fragments de microvaisseaux OB et CT est présentée pour chaque groupe d'âge (Fig. 1f). Ainsi, nous avons identifié des gènes par des analyses d'ARN seq (Fig. 1a, b) et qPCR (Fig. 1c – f) qui étaient exprimés différemment dans des fragments de microvaisseaux selon l'âge, l'infection ou la région pour une étude plus approfondie.

Pour examiner directement si les gènes sélectionnés peuvent influencer la pathogenèse virale, nous avons utilisé un modèle in vitro d'infection par les cellules endothéliales du LACV. Nous avons précédemment constaté que, bien que les cellules endothéliales infectées ne soient pas facilement détectables in vivo, elles sont infectées de manière dépendante de l'âge in vitro et cette infection est associée à des dommages directs et indirects aux cellules endothéliales17. Pour établir un test de dépistage basé sur les cellules de perturbation génique, nous avons choisi une lignée cellulaire d'endothéliome de souris, bEnd.3, car ces cellules pouvaient être infectées par LACV et se prêtaient facilement à la transfection d'ARNsi. Pour optimiser la livraison de siARN, nous avons utilisé des siARN de contrôle létaux et non ciblés (NT) pour tester différents réactifs de transfection et identifier les conditions avec une destruction cellulaire maximale avec des siARN létaux tout en maintenant une viabilité maximale avec le contrôle si-NT. Cela a identifié un protocole de livraison optimal utilisant 50 nM d'ARNsi avec le réactif de transfection Transit TKO (Fig. 2a supplémentaire). Nous avons ensuite établi trois conditions de contrôle pour le dépistage : a) une condition de base pour l'infection par le LACV avec des siARN NT, b) un contrôle des facteurs de restriction connus en utilisant une combinaison de siARN à Ifnar1 et Ifnar2 (si-Ifnar ou si-Upreg. Contrôle ; infection LACV régulée à la hausse) et c) un contrôle des facteurs de susceptibilité connus utilisant une combinaison d'ARNsi à la chaîne lourde de Clathrine et Rab5a (si-CltcRab ou si-Downreg. Control; infection LACV régulée à la baisse) (Fig. 2b, c supplémentaires).

Nous avons ensuite criblé les 35 gènes sélectionnés présentés dans le tableau supplémentaire. 1 ainsi que les trois conditions de contrôle à trois phases différentes de l'infection LACV sur des monocouches BCEC à température ambiante. La première était la phase précoce (6 hpi; Fig. 2a), qui suggérerait un effet sur l'entrée du virus. La seconde était la phase infectieuse médiane (24 hpi; Fig. 2b), suggérant un effet sur la réplication du virus et sa propagation à travers la culture de cellules endothéliales. Ces phases cinétiques ont été observées de manière similaire pour l'infection LACV dans une lignée cellulaire différente22. Le test cellulaire pour ces deux premières phases a utilisé un anticorps anti-LACV pour mesurer l'intensité de la fluorescence virale par cellule. Cela a été déterminé en mesurant l'intensité de la somme LACV (qui est influencée à la fois par le nombre de cellules infectées ainsi que par l'intensité de l'infection), puis en quantifiant le rapport à la zone Hoechst (qui normalise la valeur d'intensité au nombre total de cellules). Le dernier test de phase tardive (72 hpi; Fig. 2c) a mesuré la perte de cellules par la mort cellulaire induite par le LACV. En utilisant ces critères, on s'attendrait à ce que l'inactivation des facteurs de restriction putatifs donne une intensité LACV accrue et une viabilité cellulaire réduite, tandis que l'inactivation des facteurs de susceptibilité putatifs conduirait à une intensité LACV réduite et à une viabilité cellulaire plus élevée. Nous avons identifié deux groupes de gènes présentant des phénotypes de résistance ou de sensibilité putatifs (couleur mise en évidence sur les Fig. 2a à c), avec des images représentatives de la régulation positive ou négative du virus présentées sur la Fig. 3 supplémentaire.

Les cellules bEnd.3 ont été transfectées avec 50 nM d'ARNsi contre les gènes cibles indiqués (pendant 72 h), ainsi que le contrôle de la régulation virale (c'est-à-dire si-Ifnar1 et Ifnar2, abrégé en si-Upreg. Control), le contrôle de la régulation négative (c'est-à-dire si -Cltc et Rab5a, abrégés en si-Downreg. Control), sans ciblage (si-NT, ligne pointillée) et contrôles de mort cellulaire (si-Lethal) lorsque cela est indiqué. a, b Analyses du degré d'infection (10 MOI de LACV) normalisées à si-NT (rapport somme-intensité-surface de LACV) à 6 (a) et 24 hpi (b). c Analyses de survie cellulaire (numération nucléaire) à 72 hpi. La première barre représente la moyenne de 2 ARNsi indépendants spécifiques à un gène, tandis que les deux barres suivantes représentent les ARNsi #1 et #2 pour chaque gène (moyenne ± SD, N = 3 chaque ARNsi individuel). Les gènes de hit putatifs sont de couleur assortie sur les différents graphiques.

Les facteurs de restriction putatifs identifiés dans le dépistage primaire comprenaient Efna2, Clec4e, Gja1 (exprimé en tant que protéine Connexin43, en abrégé Cx43), la protéine transmembranaire induite par l'interféron 3 (Ifitm3, un facteur de restriction virale à ARN), le locus C2 complexe de l'antigène lymphocytaire 6 (Ly6c2) et H2q6. Pour H2q6, il y avait une variation entre 6 et 24 heures dans le phénotype, avec une augmentation de l'intensité virale observée uniquement au début (Fig. 2a, b). Des grappes d'agrégation de type syncytia et de cellules multinucléées ont été observées dans des cultures knock-down H2q6, ce qui pourrait expliquer la limitation du phénotype d'intensité virale accrue au début (flèches blanches, Fig. 3a, b supplémentaires). L'inactivation de Gja1 a provoqué la dissociation de la monocouche cellulaire (flèche blanche, Fig. 3b supplémentaire), conformément à son rôle établi dans l'intégrité de la jonction lacunaire. Les facteurs de susceptibilité putatifs comprenaient le facteur de croissance endothélial vasculaire A (Vegfa), la gelsoline (Gsn), la protéine de remodelage de l'actine-cytosquelette, la claudine 2 (Cldn2), la claudine 5 (Cldn5) et la protéine de jonction serrée 2 (Tjp2 / ZO2) (Fig. 2a – c ). Ainsi, plusieurs gènes ont été identifiés qui amélioraient ou réduisaient l'infection in vitro par le LACV des cellules endothéliales bEnd.3.

Sur la base du criblage d'ARNsi ciblé, nous avons choisi sept facteurs de restriction putatifs (gènes du groupe 1 : Bst1, Efna2, H2q6, Clec4e, Gja1, Ifitm3 et Ly6c2) pour une validation plus poussée dans les BCEC primaires adultes et sevrés. Fait intéressant, l'inactivation de tous ces gènes a augmenté la sensibilité des BCEC primaires adultes à l'infection par le LACV (Fig. 3a), tandis que seule l'inactivation d'Ifitm3 a montré un niveau d'infection significativement accru dans les BCEC primaires sevrés (Fig. 3b), soutenant l'hypothèse que ces gènes peuvent contribuent à l'augmentation de la résistance au LACV dans les BCEC adultes.

a, b Les BCEC primaires adultes (a) et sevrés (b) ont été transfectées avec 50 nM d'ARNsi pendant 72 h contre les gènes hit du groupe 1 indiqués (principalement des facteurs de restriction) et l'infection par le LACV (rapport somme-intensité du LACV sur surface de Hoechst) a été évalué (N = 6 et les points de données individuels sont présentés) Ici, P = 0,0162, 0,0085, 0,0153, 0,0830, 0,0394, 0,0636, 0,0231 et 0,0271 dans (a) et P = 0,6571, 0,9010, 0,0960, 0,1548, 0 .9290, 0.0354, 0.0649 et <0,0001 en (b) pour si-Bst1, si-Efna2, si-H2q6, si-Clec4e, si-Gja1, si-Ifitm3, si-Ly6c2 et si-Upreg. contrôle vs si-NT, respectivement. c Essai d'attachement/d'entrée de LACV dans des cellules bEnd.3 transfectées avec 50 nM des siARN spécifiques du gène indiqué et de contrôle pendant 72 h et infectées avec 10 MOI de LACV pendant 24 h. d Images représentatives de l'attachement/entrée LACV dans les cellules bEnd.3 perturbées par les siARN Ifitm3 et Lyc2 (vert : LACV et bleu : Hoechst) (N = 3 pour c, d). Ici, P = 0,0682, 0,0752, 0,9479, 0,3786, 0,3018, 0,0009, 0,0020 et 0,9574 en (c, gauche) et P = 0,0980, 0,9622, 0,6042, 0,4154, 0,9939, 0,013 2, 0,0011 et 0,0294 po (c, droite) pour si-Bst1, si-Efna2, si-H2q6, si-Clec4e, si-Gja1, si-Ifitm3, si-Ly6c2 et si-Upreg. contrôle vs si-NT, respectivement. e Essais de plaque (chaque point = 1 échantillon) effectués à 24 hpi dans des cellules bEnd.3 infectées par LACV transfectées pendant 72 h avec 50 nM de l'ARNsi spécifique au gène indiqué. Ici, P = 0,5075, 0,0030, 0,7566, 0,1347, 0,0120, 0,7941 et 0,0156 pour si-Bst1, si-Efna2, si-H2q6, si-Clec4e, si-Gja1, si-Ifitm3 et si-Ly6c2 vs si-NT, respectivement. f Les cellules bEnd.3 ont été transfectées avec 50 nM de l'ARNsi indiqué pendant 72 h, infectées avec 10 MOI LACV et la microscopie confocale a été utilisée pour imager l'infection LACV (vert), l'actine (rouge : phalloïdine) et les noyaux (bleu : Hoechst). a, b Des tests t appariés multiples et bilatéraux et c–e des tests t multiples non appariés entre si-NT et les gènes ciblés ont été effectués (*P < 0,05, **P < 0,01, *** P < 0,001 et ****P < 0,0001) et moyenne ± SD (3 à 6 échantillons par condition) sont indiqués. d, f Les images sont représentatives de 25 à 75 champs indépendants. Barre d'échelle = 100 um (blanc, pour les images régulières), barre d'échelle = 10 um (jaune, pour les images agrandies).

Nous avons également testé des facteurs de susceptibilité putatifs pour validation en culture primaire (gènes du groupe 2 : Cldn2, Tjp2, Cldn5, Vegfa, Mmp8, Mmp25 et Gsn). L'inactivation de Mmp25, un gène amélioré du sevrage, a entraîné une réduction de l'intensité du LACV dans les BCEC primaires adultes et sevrés (Fig. S4), ce qui suggère que ce gène hôte peut faciliter l'infection par le LACV. Cependant, seuls des effets marginaux ont été observés pour les autres facteurs de susceptibilité putatifs dans les BCEC primaires. Étant donné que nous avons observé une fréquence plus élevée de validation des hits pour les gènes du groupe 1 dans les cellules primaires, nous nous sommes concentrés sur les gènes de ce groupe pour une analyse plus approfondie.

Dans un effort pour disséquer les mécanismes d'inhibition du virus, nous avons ensuite utilisé les cellules bEnd.3 pour examiner les étapes auxquelles la perturbation des facteurs de restriction putatifs peut limiter la réplication du virus. Des tests d'attachement/d'entrée (induisant une liaison virale à basse température, voir la section méthodes) ont montré que deux gènes, Ly6c2 et Ifitm3, restreignaient l'entrée virale (Fig. 3c). Comparé à si-Ly6c2, l'inactivation de si-Ifitm3 a provoqué une régulation à la hausse plus faible du nombre de cellules infectées ainsi que de l'intensité / cellule LACV (Fig. 3c, d). Nous avons ensuite effectué des tests sur plaque et constaté que la perturbation de Ly6c2, Gja1 et Efna2 augmentait la production de virus à 24 hpi (Fig. 3e).

Dans notre criblage principal, nous avions noté que l'inactivation du gène H2q6 induisait également la formation d'agrégations de type syncytia dans les cellules bEnd.3 (Fig. 3a, b supplémentaires). Pour étudier cela plus en détail, des cellules bEnd.3 témoins et perturbées par H2q6 ont été co-colorées pour le LACV et la F-actine. Il a été rapporté précédemment que les protéines du cytosquelette d'actine sont altérées dans les BCEC OB après une infection par le LACV16. Nous avons observé que LACV colocalisait avec le réseau d'actine dans les cellules témoins, en particulier à la périphérie cellulaire et aux extensions lamellipodiales (flèche fine, panneau supérieur, Fig. 3f). Cependant, dans la condition de knockdown H2q6, spécifiquement dans les cellules ayant deux noyaux ou plus (formant une agrégation de type syncytia), nous avons observé une perturbation de la coloration régulière de l'actine filamenteuse et de la coloration granulaire de l'actine et du LACV situés autour des noyaux cellulaires (flèche épaisse, panneau inférieur , Fig. 3f) suggérant une altération potentielle du trafic de virus. Ainsi, la validation in vitro des facteurs de restriction viraux putatifs (Efna2, H2q6, Clec4e, Gja1, Ifitm3) identifiés à partir de notre criblage de siARN ciblé suggère des rôles possibles pour certains gènes hôtes dans la restriction ou la modification de l'entrée virale, du trafic ou de la libération de particules virales dans LACV -cellules endothéliales infectées.

L'un des principaux gènes qui ont affecté de manière significative l'infection par le LACV des cellules endothéliales était Efna2, qui est intrinsèquement abondant dans les BCEC adultes. La protéine codée EFNA2 est un facteur angiogénique23 qui effectue des réponses de signalisation via les récepteurs de classe EphrinA (EphA)24. Pour examiner plus en détail l'EFNA2, nous avons testé si la protéine EFNA2 de souris recombinante (rec-EFNA2) pouvait limiter l'infection par le LACV chez les BCEC primaires sevrés et adultes. Les BCEC primaires sevrés et adultes ont été cultivés, infectés par LACV (10 multiplicités d'infection; en abrégé MOI), puis maintenus dans un milieu conditionné ou témoin EFNA2 jusqu'à 72 h après l'infection. Deux concentrations différentes d'EFNA2, faible (2 ug/ml) ou élevée (20 ug/ml) ont été utilisées. Lors du traitement rec-EFNA2, les BCEC sevrés ont montré des niveaux réduits d'infection par le LACV à 24 hpi, ce qui était significatif pour la concentration élevée d'EFNA2 (Fig. 4a). Les BCEC adultes, déjà pour la plupart résistants à l'infection par le LACV, ont montré une réduction partielle mais non significative de l'infection. Ainsi, l'EFNA2 ajouté de manière exogène peut restreindre la réplication in vitro du LACV dans les BCEC sevrés (Fig. 4a).

a Effet de l'EFNA2 recombinant (2 ug/ml à 20 ug/ml) sur les niveaux d'infection par le LACV dans les BCEC sevrés et adultes à 24 et 72 hpi (N = 4–12 échantillons individuels, données collectées sur la base de 25 images pour chaque échantillon, P = 0,1654 et 0,0475 pour 2 ug/ml et 20 ug/ml, par rapport au témoin, dans les BCEC sevrés et P = 0,1068 et 0,0846 pour 2 ug/ml et 20 ug/ml, par rapport au témoin, dans les BCEC adultes). b Des souris adultes Efna2 - / - (m), Efna2 + / - (m) et WT ont été infectées avec 105 PFU LACV (IP) et le pourcentage de souris neurologiques est indiqué. Voir Suppl. Tableau 3 pour les génotypes mixtes Efna3/5 de souris Efna2−/− (m) et Efna2+/− (m) (N = 22 souris WT ou Efna2+/− (m) et N = 18 souris Efna2−/− (m), P = 0,0105). c Niveaux d'ARN LACV dans le cerveau des souris infectées à 8–22 dpi (NC : souris non cliniques et C : souris cliniques où N = 18 WT ou Efna2+/− (m) souris NC, N = 2 WT ou Efna2+/− (m ) souris C, N = 10 souris Efna2-/- (m) NC et N = 8 souris Efna2-/- (m) C). Ici, P = 0,0008 pour WT/Efna2+/− (m) C et Efna2−/− (m) C, par rapport au contrôle WT/Efna2+/− (m) NC. d Fuite vasculaire évaluée par la mesure de l'ARN viral dans des cerveaux de souris Efna2-/- (m) et WT infectés par LACV à 3 dpi (N = 8 cerveaux de souris concernant chaque condition analysée). e Imagerie pour détecter les fuites vasculaires dans des tranches de cerveau de souris WT et Efna2−/− (m) infectées par LACV à 3 dpi (flèche, perles FluoSphere : rouge, Hoechst : bleu). Les flèches épaisses représentent la localisation des billes FluoSphere à la périphérie du SNC chez les souris WT tandis que les flèches fines représentent la fuite des billes FluoSphere dans le parenchyme cérébral chez la souris Efna2-/- (m) (1 souris sur 4 a montré une fuite, qui est représentée ici). (a, ANOVA à un facteur suivi d'un test de Dunnett post-hoc, b, test du log-rank de Mantel-Cox et c, d tests t bilatéraux non appariés multiples, *P < 0,05, **P < 0,01 et *** P < 0,001). Barre d'échelle = 100 um.

Pour examiner si Efna2 joue un rôle dans la restriction de l'infection LACV du SNC in vivo, nous avons analysé le développement d'une maladie neurologique chez des souris adultes normalement résistantes déficientes en membres de la famille Efna. Nous avons initialement testé des souris âgées de plus de 6 semaines qui présentaient des génotypes de déficience mixtes pour Efna2, Efna3 et Efna5 (Efna2-/- mixte ; abrégé en Efna2-/- (m)), comme détaillé dans le tableau supplémentaire 3. Toutes les souris ont été réparties en deux groupes. : homozygote pour le déficit en Efna2 de génotypes mixtes +/+, +/− ou −/− pour Efna3 et Efna5 (Efna2−/− (m) ou hétérozygote pour le déficit en Efna2 de génotypes mixtes +/+, +/− ou −/− pour Efna3 et Efna5 (Efna2+/− (m)) ainsi que des souris de type sauvage avec le génotype Efna2+/+3+/+5+/+ (type sauvage, en abrégé WT). Après inoculation de 105 PFU/souris, environ 50 % de Les souris Efna2−/− (m) ont développé une maladie neurologique, quel que soit leur génotype Efna3 ou Efna5 (tableau supplémentaire 3).En revanche, la plupart des souris WT ou Efna2+/− (m) (~ 91 %) n'ont montré aucun signe. de maladie neurologique (Fig. 4b). Nous avons également observé des niveaux élevés de virus chez les souris Efna2 - / - (m) atteintes d'une maladie neurologique clinique (C) par rapport aux souris non cliniques (NC) (Fig. 4c). Ainsi, Efna2 semble avoir un rôle inhibiteur dans la pathogenèse du LACV in vivo (Fig. 4b, c).

Pour déterminer si le déficit en Efna2 affecte la perméabilité de la BBB et la neuroinvasion du LACV, nous avons examiné des souris à 3 dpi, quatre jours avant l'apparition des signes cliniques. L'ARN LACV a été détecté chez environ la moitié des souris Efna2 −/− (m), mais chez une seule souris du groupe WT et Efna2 +/− (m) (Fig. 4d). Ces souris Efna2 - / - (m) infectées par LACV ont également reçu une injection de billes FluoSphere rouges d'environ 100 nm (particule de la taille d'un virus; coloration rouge) à 3 dpi pour surveiller les fuites vasculaires. Les fluorosphères ont été principalement détectées dans les vaisseaux sanguins du SNC chez les souris WT (flèches blanches épaisses). Cependant, chez l'une des quatre souris Efna2-/-, des fluorosphères ont été détectées dans le parenchyme cérébral (fines flèches blanches, Fig. 4e) suggérant une fuite vasculaire précoce. Ainsi, l'augmentation de 25 à 50 % de la maladie chez les souris Efna2-/- (m) était corrélée à une incidence accrue de détection précoce d'ARN viral dans le SNC et à la détection de fuites vasculaires dans un sous-ensemble de ces souris. Ces données indiquent que Efna2 peut être un facteur de restriction important chez les souris adultes pour prévenir la neuroinvasion LACV.

Pour clarifier si Efna2 lui-même était le principal médiateur de la restriction virale, nous avons comparé la sensibilité au LACV chez les souris adultes (> 6 semaines) WT et Efna2−/−3+/+5+/+ (Efna2 single knockout (KO) ; abrégé en Efna2−/−(s)). Comme prévu, les souris WT adultes n'étaient pas sensibles à une dose de LACV de 105 PFU/souris (~ 96 % non neurologique). En revanche, environ 38% des souris Efna2 - / - (s) adultes ont développé une maladie neurologique en réponse à une infection LACV (Fig. 5a). De plus, les fragments de microvaisseaux isolés à partir de souris Efna2-/-(s) présentaient des niveaux d'infection LACV plus élevés par rapport à WT à 24 et 48 hpi (Fig. 5b, d) et une survie réduite à 72 et 96 hpi (Fig. 5c). Nous avons également examiné les fuites vasculaires in vivo à l'aide de fluorosphères chez des souris WT et Efna2 - / - (s) en utilisant un point de temps légèrement plus tardif de 5 dpi. Les souris adultes WT n'ont montré aucune fuite vasculaire, tandis que les souris Efna2 − / − (s) avaient une détection constante de 1 à 3 foyers de billes fluorescentes dans le parenchyme cérébral (Fig. 5e, 5 souris sur 7). Ainsi, les souris Efna2-/- (s) étaient plus sensibles aux maladies neurologiques induites par le LACV, qui étaient corrélées à une augmentation des fuites vasculaires dans le SNC avant l'apparition de la maladie. Cela était également corrélé à une augmentation de l'infection virale et à une diminution de la survie cellulaire dans les BCEC Efna2 - / - (s) par rapport aux BCEC WT (Fig. 5b, c). Collectivement, ces données indiquent un rôle important pour Efna2 dans l'intégrité de la BHE lors d'une infection LACV.

a Comparaison des maladies neurologiques induites par le LACV (105 PFU/dose de souris (IP)) chez les souris adultes WT et Efna2−/−. (*P < 0,05, ****P < 0,0001, test du log rank de Mantel-Cox, N = 28 souris WT et N = 43 souris Efna2−/−, P = 0,0013). b Infection comparative des BCEC après infection LACV (10 MOI) à 24 et 48 hpi sur les BCEC primaires WT et Efna2−/− (N = 33 et N = 18 pour les BCEC WT et Efna2−/−, la moyenne ± SD est indiquée, P < 0,0001 et P = 0,0041 pour 24 et 48 hpi, respectivement). c Viabilité cellulaire comparative (numération nucléaire validée) des BCEC après infection par LACV (10 MOI) à 72 et 96 hpi sur les BCEC primaires WT et Efna2−/− (N = 24 et N = 12-18 pour les BCEC WT et Efna2−/− , la moyenne ± SD est indiquée, P < 0,0001 et P = 0,0304 pour 72 et 96 hpi, respectivement). Tous les points de données individuels sont affichés et la signification statistique est analysée par de multiples tests t bilatéraux non appariés, *P < 0,05, **P < 0,01 et ****P < 0,0001). d Images représentatives à 24 et 48 hpi comparant les BCEC WT et Efna2−/− (Hoechst : bleu et LACV : vert). Barre d'échelle = 100 um (les images sont représentatives de 25 images individuelles/échantillon). e Une coupe représentative du cerveau WT (sans aucune fuite vasculaire) est illustrée avec 5 coupes cérébrales Efna2−/− démontrant une fuite vasculaire (Hoechst : perles bleues et FluoSphere : rouge et barre d'échelle = 100 um) (N = 5 cerveaux WT et N = 7 cerveaux Efna2−/−, dont 5 cerveaux ont montré des foyers probables de fuite vasculaire). Le nombre de foyers/cerveaux a été comparé à l'aide d'un test t non apparié (P = 0,0195).

Étant donné que l'inactivation de Gja1 (qui exprime la protéine Cx43) a eu un impact sur l'infection LACV in vitro, nous avons émis l'hypothèse que l'activation ou la régulation positive de Cx43 pourrait réduire l'infection virale et la pathogenèse. L'acide 4-phénylbutyrique (4-PBA) est un activateur connu et un activateur de formation de canaux pour plusieurs connexines, y compris Cx43. Nous avons infecté des cellules bEnd.3 avec LACV + /− 4-PBA et immunocoloré pour LACV et Cx43 à différents moments. Le traitement au 4-PBA a réduit de manière significative l'infection par le LACV et augmenté la survie des cellules hôtes à 96 hpi (Fig. 6a). À l'aide de la microscopie confocale, nous avons observé que la réduction de l'infection LACV (LACV : vert) à 96 hpi était corrélée à l'amélioration de la formation de Cx43 puncta (Cx43 : rouge). L'augmentation de la formation de points lacrymaux Cx43 (flèches blanches ; indiquée par une coloration Cx43 granulaire ou laminaire) ou la localisation vers la surface cellulaire était dépendante de la dose de 4-PBA (Fig. 6b)25. Comme observé dans des études précédentes25, la régulation à la hausse du niveau de protéine Cx43 était confirmé par western blot (Fig. 6c). Ainsi, la régulation à la hausse induite par le 4-PBA dans les niveaux de protéine Cx43 ou la formation de points lacrymaux était corrélée à l'inhibition de l'infection LACV in vitro.

a, b Les cellules bEnd.3 infectées par LACV (10 MOI) ont été traitées avec du 4-PBA (0–10 mM) et à différents hpi, imagées pour mesurer (a) l'intensité virale ou la déplétion cellulaire induite par le virus (N = 4 échantillons, les données recueillies sur la base de 25 images obtenues à partir de chaque échantillon et la moyenne avec SD sont affichées) ou (b) localisation de Cx43 (rouge), LACV (vert) et Hoechst (bleu) (représentant de ~ 12 à 25 images obtenues chaque condition , P = 0,1142, < 0,0001 et 0,0097 à partir de PBA 2,5, 5 et 10 mM, par rapport à PBA 0 mM). Les flèches blanches représentent la coloration ponctuée de Cx43. c Western blot et analyses densitométriques des niveaux de protéine Cx43 dans les cellules bEnd.3 traitées au 4-PBA. Gapdh est un contrôle de charge et un facteur de normalisation pour la quantification (N = 3 chaque condition et la moyenne avec SD est indiquée, P = 0,7647, 0,0043 et 0,4589 pour PBA 2,5, 5 et 10 mM ceux-ci sont comparés à PBA 0 mM). d Des souris sevrées, infectées avec 2000 PFU de LACV, ont été traitées avec le véhicule (LV) ou 500 mg/kg-jour de 4-PBA (LP) jusqu'à 5 dpi et évaluées pour le critère neurologique (N = 9 souris pour chaque condition, P = 0,0074). e Effet du traitement au 4-PBA sur la corrélation entre l'expression de LACV et de Gja1 dans le cerveau de souris à 3 dpi (N = 9 LV et N = 11 échantillons d'ARN cérébral LP obtenus à partir de souris, P = 0,0311 et 0,0147 pour la comparaison LACV et Gja1). f Effet du 4-PBA sur l'entrée et la localisation du LACV, évalué par imagerie confocale de tranches de cerveau de souris à 4 dpi (rouge : ZO1, vert : LACV, bleu : Hoechst/noyaux). (a) ANOVA bidirectionnelle suivie du test de Dunnett et tous les groupes ont été comparés au véhicule pour le même temps pi, (b) ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Dunnett, les points individuels représentent des champs d'imagerie séparés, (c) multiple, bilatéral tests t non appariés, d test du log-rank de Mantel-Cox et e, test t bilatéral non apparié où *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001 et N = 3–4 pour chaque expérience. Barre d'échelle = 100 um (blanc, pour les images régulières), barre d'échelle = 10 um (jaune, pour les images agrandies).

Pour examiner si le 4-PBA pouvait inhiber la maladie neurologique induite par le LACV, des souris sevrées infectées par le LACV (âgées d'environ 21 à 23 jours) ont été traitées quotidiennement avec 500 mg/kg de 4-PBA de 0 à 5 dpi (injection IP, LP). Les souris infectées par le LACV et traitées par le véhicule (LV) ont été analysées en parallèle. Les souris LV présentaient une maladie neurologique entre 6 et 8 dpi. En revanche, les souris LP présentaient un développement retardé de la maladie neurologique (Fig. 6d). Au point final neurologique, les niveaux de virus et les niveaux d'expression de l'ARNm de Gja1 étaient similaires dans les groupes traités avec le véhicule et le 4-PBA (Fig. 5 supplémentaire). Cependant, une analyse antérieure à 3 dpi, lorsque le virus envahit le SNC pour la première fois, a démontré que les animaux LP présentaient des taux de virus réduits, ce qui était corrélé à une augmentation de l'expression de l'ARNm de Gja1 (Fig. 6e). À 4 dpi, les cerveaux ont été isolés de souris LV et LP et co-colorés pour le marqueur endothélial ZO1 et LACV. Les souris LV ont montré une présence persistante et proéminente de coloration LACV dans les régions OB et OT du cerveau (Fig. 6f; panneaux supérieurs). En revanche, les souris traitées au 4-PBA n'avaient pas de LACV détectable (3 souris sur 4) ou une coloration virale beaucoup plus limitée (1 souris sur 4, (Fig. 6f; panneaux inférieurs)) par rapport aux témoins du véhicule. Des images à plus fort grossissement montraient une infection LACV importante dans le parenchyme cérébral dans une zone hautement vascularisée chez les souris LV, tandis que l'infection LACV était principalement limitée à la lumière vasculaire à 4 dpi chez les souris LP (Fig. 6f, panneaux de droite). Notamment, les particules virales ont été restreintes à l'intérieur des vaisseaux sans établir une fuite suffisante à l'intérieur du parenchyme cérébral à 4 dpi. Ainsi, le traitement au 4-PBA a induit une régulation à la hausse de Cx43 et pourrait partiellement limiter l'infection virale et sa dissémination dans la région OB/OT au stade précoce de l'infection par le LACV.

La susceptibilité à l'infection par le LACV liée à l'âge dépend, en partie, de la capacité du LACV à induire une fuite vasculaire et à accéder au SNC16. Dans cette étude, nous avons adopté une approche systématique de « dépistage à ciblage » pour découvrir les différences d'expression génique entre les fragments de microvaisseaux sevrés et adultes (ex vivo) / BCEC (in vitro) qui peuvent contribuer à la sensibilité différentielle du LACV. Les analyses transcriptomiques ont démontré que les gènes pouvaient être divisés en plusieurs groupes spécifiques à l'âge, au système immunitaire ou à la localisation cérébrale. Nous avons ensuite utilisé une bibliothèque d'ARNsi ciblée pour étudier le rôle de ces facteurs dans le contrôle de l'infection virale et la mort cellulaire associée. À partir du dépistage de suivi, de l'étude de validation et des analyses mécanistes, nous avons trouvé plusieurs gènes, principalement des facteurs de restriction, qui pourraient être importants pour contrôler les fuites vasculaires induites par le LACV chez les adultes et pourraient fournir des cibles thérapeutiques pour améliorer la résistance au LACV chez les enfants.

Une voie prévisible dans ce modèle de fuite BCEC aurait été l'altération des protéines TJ. Plusieurs virus, y compris le virus de l'hépatite C et le virus de la dengue, utilisent les TJ pour pénétrer dans la cellule26, tandis que les facteurs d'entrée LACV sont largement inconnus21,27. Dans notre dépistage primaire, l'inactivation des TJ Cldn2 et Cldn5 a entraîné une réduction de l'infection par le LACV, tandis que l'inactivation de Cldn1 n'a montré aucun effet significatif. Cependant, l'influence de ces gènes a été étudiée dans une culture monocouche sans contrainte. Comme la conformation des BCEC est très importante à l'intérieur des vaisseaux sanguins in vivo, la perturbation des TJ pourrait contribuer à l'entrée du LACV dans les cellules sensibles. Sur une note connexe, nous avons observé que l'altération de l'expression de GJ pourrait être un facteur important pour contrôler l'infection par le LACV et les dommages aux BCEC. Nous avons spécifiquement observé que l'une des principales protéines GJ endothéliales cérébrales, Cx43, exprimée par l'ARNm28 Gja1 aide à contrôler l'infection LACV dans les cellules bEnd.3.

À partir de l'ARN-seq, du criblage de siRNA ciblé et d'autres analyses de suivi, nous avons étudié plusieurs gènes qui ne sont pas directement impliqués dans le maintien des jonctions cellulaires, notamment Bst1, Clec4e, Efna2, H2q6, Ifitm3 et Ly6c2. Bien que Bst1 soit un marqueur des cellules souches endothéliales ayant des propriétés régénératives29 et prévalent dans les BCEC sevrés, ce gène n'avait pas de fonction régulatrice majeure dans notre étude. Des régulateurs immunitaires bien caractérisés, comme Clec4e, H2q6 et Ifitm3, ont des rôles définis dans LACV ou d'autres infections virales. Clec4e induit une réponse antivirale contre LACV21 et limite (partiellement) l'infection virale et la production de plaque dans notre étude30. H2q6, une partie du CMH de classe I, a des fonctions importantes dans la présentation de l'antigène30 et, en particulier dans les cellules endothéliales, il module le réseau cytosquelettique d'actine et survie cellulaire31,32. L'infection par le LACV peut entraîner un remodelage du réseau d'actine16 qui peut être associé à des effets cytopathiques observés dans les BCEC en culture17. Fait intéressant, l'inactivation de H2q6 a produit une infection virale plus élevée et une formation d'agrégation de type syncytia associée à la fragmentation de la F-actine. Ifitm3 est un facteur de restriction viral connu qui bloque l'entrée33 ou la fusion dépendante du pH34. En conséquence, l'inactivation d'Ifitm3 a induit une intensité d'infection LACV plus élevée dans les BCEC avec un nombre plus élevé de cellules infectées. Bien que Ly6c2 endothélial n'ait pas de rôle précédemment rapporté dans l'infection virale, nous avons observé une amélioration de l'attachement/entrée virale, de l'infection, de la réplication et de la dissémination du LACV avec l'inactivation de Ly6c2. Bien que nous ayons concentré notre analyse de suivi sur les facteurs de restriction putatifs, Mmp-25 était le seul facteur de susceptibilité putatif amélioré par BCEC sevré dont le renversement a réduit l'infection virale dans les BCEC primaires, ce qui peut justifier une analyse plus approfondie. Dans l'ensemble, ces observations suggèrent que la sensibilité au LACV spécifique à l'âge des BCEC est contrôlée par un réseau multigénique complexe de facteurs qui facilitent la résistance de l'hôte chez les adultes.

Parmi ces facteurs, Efna2 amélioré pour adultes a montré un phénotype distinctif dans le contrôle de l'infection virale dans les cellules bEnd.3 et les BCEC primaires et dans la production de plaques virales. Efna2 est une molécule de signalisation appartenant à la famille Ephrin (Efn), qui, par le biais d'interactions apparentées avec les récepteurs Eph, est impliquée dans l'angiogenèse et le maintien des cellules endothéliales. Efna2 a été récemment établi pour avoir des rôles allant du développement neuronal, de la différenciation et de la migration35,36,37 à l'angiogenèse et aux métastases cancéreuses23. Dans notre étude, nous avons observé un traitement direct des BCEC avec rec-EFNA2 réduit l'infection virale in vitro. L'observation initiale d'une sensibilité accrue au LACV des souris adultes Efna2−/− (m) présentant un déficit mixte en Efna3/5 a suggéré que les molécules d'EphrinA pourraient jouer un rôle dans la résistance aux maladies neurologiques induites par le LACV. Cela a été confirmé par la sensibilité observée des souris KO simples Efna2 - / - (s), suggérant que le gène Efna2 est un facteur critique pour la résistance au LACV chez les souris adultes. De même, les BCEC isolés à partir de souris Efna2-/-(s) étaient plus sensibles à l'infection LACV in vitro et à la mort cellulaire induite par l'infection. En outre, un nombre important de souris Efna2-/- (s) infectées par le LACV ont montré une fuite de particules de la taille d'un virus dans le parenchyme du SNC. Ceci propose un rôle pivot pour Efna2 en conférant la résistance virale. La question de savoir si Efna2 pourrait être ciblée in vivo à des fins thérapeutiques sera un sujet important pour les recherches futures.

Comme indiqué précédemment, les protéines CJ sont des cibles de choix pour réguler l'entrée virale par la BHE et nous avons identifié le produit du gène Gja1 Cx43 comme un autre facteur de restriction potentiel. Des études antérieures ont montré que des virus comme le virus du sarcome de Rous38, le VIH39 ou l'infection par le virus de l'hépatite de la souris40,41 peuvent moduler l'expression et la fonction de Cx43 dans différents types de cellules. L'infection par le virus de la peste porcine classique a également appauvri la Cx43 dans les cellules endothéliales42, mais le rôle de la Cx43 et la question de savoir si son renforcement pourrait limiter l'infection par le buniavirus n'ont pas été étudiés auparavant. Dans le but de réduire les fuites virales chez les animaux sevrés sensibles, nous avons utilisé le 4-PBA, un activateur de petite molécule connu et bien caractérisé de Cx4343. Le 4-PBA régule à la hausse une protéine du réticulum endoplasmique (RE) luminal de 29 kDa (ERp29)44,45, qui contrôle la biosynthèse et le trafic de Cx4346. Bien qu'il reste à déterminer si l'activation de chaperons comme ERp29 est le mécanisme sous-jacent de la réduction induite par le 4-PBA du LACV dans les BCEC, cette stratégie représente une approche prometteuse pour lutter contre l'encéphalite induite par le LACV. Il convient de noter que l'administration de 4-PBA au début de l'exposition virale était suffisante pour diminuer l'entrée virale et les symptômes neurologiques, ce qui peut indiquer une réponse particulièrement rapide à cette thérapeutique potentielle.

En résumé, nous avons utilisé une approche systématique de criblage transcriptomique et de perturbation génique pour identifier les gènes ou les produits géniques impliqués dans le contrôle de la sensibilité LACV des BCEC et des fuites vasculaires induites par l'infection. Nous avons identifié EFNA2 et Cx43 comme deux facteurs importants soutenant la résistance spécifique des adultes à l'infection LACV. L'identification de deux régulateurs moléculaires différents impliqués dans la régulation de la neuroinvasion LACV suggère une synergie entre plusieurs effecteurs qui régulent les différences entre la BHE immature et mature qui ont un impact sur la capacité des virus tels que LACV à accéder au SNC et à provoquer une maladie neuroinvasive.

Toutes les études sur les animaux ont été menées selon le protocole animal RML-2018-018-E, LISB 3E et LISB 4E, conformément aux principes de protection des animaux de laboratoire et conformément et approuvés par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux NIH/NIAID/RML. Aucun échantillon humain n'a été utilisé dans cette étude. La plage de température à l'intérieur de la cage des animaux et de la salle d'attente des animaux était de 20 à 24 ° C et la plage d'humidité était de 30 à 70%. Un cycle lumière/obscurité de 12 h (6 h à 18 h) a été maintenu en permanence. Toutes les souris ont été euthanasiées après l'expérience.

Des souris sevrées (~3 semaines) et adultes (> 6 semaines) ont été traitées avec 100 ug de Poly I:C (HMW) dilué dans une solution de réactif de transfection LyoVec à 0,5 mg/mL (Invivogen) via un rétroorbital de 100 ul (IV ) injection. Le réactif LyoVec a été reconstitué à l'aide de l'eau stérile déionisée fournie conformément aux recommandations du fabricant et a été utilisé seul comme véhicule de contrôle. Des fragments de microvaisseaux ont été retirés des animaux traités et du véhicule 3 h après l'injection. Pour comparer l'expression du transcrit de fragments de microvaisseaux OB par rapport à CT à partir de LACV et de conditions d'infection fictives, des souris sevrées C57BL / 6 ont été infectées avec une dose IP de 2000 PFU de LACV diluée dans 200 ul de PBS stérile de qualité pharmaceutique. Les souris factices ont reçu un volume équivalent de surnageant Vero non infecté dilué dans du PBS. Des fragments de microvaisseaux d'OB et de CT ont été isolés à partir de LACV et de souris infectées fictives à 3 dpi. Les ARN ont été extraits de fragments de microvaisseaux comme décrit ci-dessous et purifiés à l'aide de billes Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter, Brea, CA). La concentration d'ARN a été mesurée à l'aide de la méthode de quantification d'ARN fluorescent RiboGreen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). La pureté et l'intégrité de l'ARN ont été évaluées à l'aide de la spectrophotométrie UV Nanodrop 8000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) et du test de puce Bioanalyzer RNA 6000 Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), respectivement. Des bibliothèques de séquençage ont été générées à partir d'ARN de 115 ng (adulte/sevré) ou de 170 ng (OB/CT) à l'aide du kit de préparation d'échantillons d'ARNm TruSeq Stranded, conformément au protocole recommandé par le fabricant (Illumina, Inc., San Diego, CA). Les bibliothèques TruSeq finales et purifiées ont été quantifiées à l'aide du kit Kapa SYBR FAST Universal qPCR pour le séquençage Illumina (Kapa Biosystems, Wilmington, MA), diluées à 2 nM et regroupées de manière égale. Les bibliothèques ont été séquencées sur l'instrument HiSeq 2500 à l'aide du kit TruSeq Rapid PE Cluster et du kit Rapid 200 cycle SBS (Illumina, Inc., San Diego, CA).

Les séquences d'adaptateurs ont été supprimées des fichiers fastq bruts à l'aide de CutAdapt47 et filtrées par qualité et ajustées à l'aide de la boîte à outils FASTX 0.0.14 (Hannon Lab, CSHL, RRID:SCR_005534). Les lectures filtrées et ajustées de qualité ont été mappées sur la séquence de référence de souris GRCm38 à l'aide de Hisat2 version 2.1.0 avec des paramètres de paramètres -no-unal -no-mixed48. Les fichiers d'alignement ont été utilisés comme entrée pour HTSeq-count de la bibliothèque Python HTSeq version 0.9.149 pour générer le nombre de gènes à l'aide du fichier d'annotation de référence GRCm38. Les matrices de comptage brut ont été utilisées comme entrée pour l'analyse de l'expression différentielle à l'aide de DESeq250. Les gènes ont été classés en fonction du changement de pli logarithmique rétréci (lfc) de DESeq et de la valeur p ajustée. Les données acquises ont été filtrées en utilisant la signification statistique, la moyenne de base (lecture du nombre de gènes cibles) et le changement de facteur log2 et ont été introduites dans R (version 3.6.0), Ingenuity Pathway Analysis (IPA, version 84978992, Qiagen) et SIGNAL (version 2.0) software51 pour comprendre les voies et les gènes impliqués dans les effets immunostimulants liés à l'âge sur les microvaisseaux cérébraux. En comparant différents groupes, environ 50 gènes ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie de l'infection LACV.

Toutes les études sur les animaux ont été menées selon le protocole animal RML-2018-018-E, LISB 4E et LISB 3E, en respectant les principes de protection des animaux de laboratoire et conformément et approuvés par le NIH/NIAID/RML ou le NIH/NIAID/Bethesda Institutional Animal Comité d'entretien et d'utilisation. Des souris C57BL/6 (obtenues auprès de Jackson Laboratories) ou Efna2-/- (m) ou Efna2-/-(s) ont été maintenues dans une colonie d'élevage au RML ou au Bethesda Campus. Le stock humain LACV de 1978, un don aimable du Dr Richard Bennett, a été utilisé pour étudier la pathogenèse du LACV chez la souris1, tel qu'il a été dilué à la dose appropriée dans 200 µl de PBS stérile de qualité pharmaceutique pour l'inoculation. Les sevrés (âgés d'environ 3 semaines) ont été inoculés IP avec une faible dose de 2000 PFU/souris, tandis que les adultes (âgés de > 6 semaines) ont été inoculés IP avec 105 PFU. Des souris inoculées fictives ont été inoculées avec 200 ul de PBS avec la quantité appropriée de surnageant cellulaire provenant de cellules Vero non infectées pour correspondre au volume des dilutions de virus. Les cerveaux entiers ou les régions OB-CT ont été isolés séparément du LACV et des souris inoculées fictives à 3 dpi. Le tableau supplémentaire 4 représente l'abréviation de la plupart des groupes expérimentaux et d'autres nomenclatures utilisées tout au long de ce manuscrit.

Les microvaisseaux cérébraux ont été isolés et cultivés comme décrit précédemment17. En bref, après perfusion transcardiale avec du PBS stérile, des cerveaux entiers de souris sevrées et adultes ont été isolés, suivis d'un hachage en petits morceaux. Une digestion de 1 h a ensuite été effectuée sur les morceaux de cerveau en utilisant 10 mg/ml de collagénase (CLS2 ; Worthington Biochemical) dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM ; Sigma) dans un incubateur-agitateur à 37 °C. Les tissus digérés ont été séparés des débris cellulaires et des lipides de la substance blanche par centrifugation à 1000 g pendant 20 min, en présence d'une solution d'albumine de sérum bovin (BSA) à 20 % préparée dans du DMEM. Une solution de 10 mg/ml de collagénase/dispase (Roche Applied Science) dans du DMEM a été ajoutée au culot résultant et incubée pendant 45 min à 1 h à 37 °C. Les fragments de microvaisseaux obtenus à partir de cette étape ont été séparés sur un gradient Percoll continu à 33 % qui a été centrifugé à 1000 g pendant 10 min. Enfin, les fragments de microvaisseaux ont été collectés et lavés deux fois dans du DMEM avant de les utiliser pour des expériences ex vivo et in vitro. Pour la comparaison OB et CT, ces régions spécifiques ont été isolées à l'aide de pinces à pointe fine et le même protocole que ci-dessus a été suivi pour isoler les fragments de microvaisseaux de ces différentes régions du cerveau.

Les fragments de microvaisseaux ont été étalés sur des lames à chambre ou des plaques multipuits recouvertes de collagène de type IV (Sigma) et de fibronectine humaine (Sigma). Le DMEM additionné de 20 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de glutamine, 1 ng/ml de facteur de croissance des fibroblastes 2 (R&D Systems) et 4 μg/ml de puromycine (Sigma) a été utilisé pour la culture des BCEC primaires incubés dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 et à 95 % d'air à 37 °C. La lignée de cellules endothéliales de souris, bEnd.3 (ATCC, CRL-2299) a été cultivée de manière similaire en utilisant du DMEM additionné de 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % de glutamine. Pour les expériences in vitro, des monocouches confluentes ont été inoculées avec différents MOI de LACV (pour la normalisation), et un MOI de 10 a été utilisé pour les expériences. Après 1,5 h, du milieu frais a été ajouté sur le dessus et les cellules ont été analysées aux moments souhaités. Des échantillons fictifs inoculés ont été maintenus en parallèle.

L'ARN total a été isolé à partir de fragments de microvaisseaux isolés ex vivo ou de BCEC cultivés à l'aide de kits d'isolement d'ARN de Zymo Research, en utilisant le protocole du fabricant. L'ARN total a été traité avec de la DNase I (Invitrogen) pendant 30 min à 37 ° C et a été purifié sur des colonnes de nettoyage d'ARN (Zymo Research). Les ADNc ont été préparés à partir d'échantillons d'ARN nettoyés à l'aide du kit de transcription inverse iScript (Bio-Rad Laboratories) en suivant les instructions du fabricant. Les échantillons d'ADNc ont été dilués cinq fois dans de l'eau sans Rnase et ces échantillons dilués ont été utilisés pour l'analyse de l'expression génique par qPCR en utilisant SYBR Green SuperMix avec ROX (Bio-Rad Laboratories). Pour toutes les analyses, Gapdh a été utilisé comme gène de contrôle domestique. Les séquences d'amorces utilisées dans cette étude sont fournies dans le tableau supplémentaire 5.

Les cerveaux de souris, lors de l'ablation chirurgicale, ont été conservés à -80 ° C jusqu'à ce qu'ils soient décongelés avec le tampon de lyse fourni dans le kit Rneasy Lipid Tissue Mini (Qiagen). Les cerveaux ont été homogénéisés à l'aide d'un TissueRuptor (Qiagen) et l'extraction de l'ARN a été effectuée en utilisant le protocole du fabricant et en utilisant le même kit. La concentration a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) et l'ADNc a été synthétisé à l'aide d'un kit de synthèse d'ADNc iScript (Bio-Rad Laboratories). La même quantité d'ADNc a été utilisée pour la PCR en temps réel en utilisant le système SYBR Green Assay (Applied Biosystems) pour mesurer l'ARN LACV ou les dosages PCR en temps réel TaqMan (Thermo Scientific) pour détecter Gja1 en utilisant le protocole du fabricant. Des contrôles de gènes de ménage appropriés ont été effectués et les valeurs CT ont été mesurées à l'aide d'une machine QuantStudio 6 Flex (Applied Biosysterms) ou d'un système Applied Biosystems ViiA 7. Le logiciel QuantStudio Real-Time PCR a été utilisé pour extraire les données.

Les protéines cellulaires bEnd.3 ont été extraites à 96 hpi (10 MOI de dose d'inoculum LACV) en utilisant un tampon RIPA (Thermo Scientific) avec un cocktail d'inhibiteurs de protéase (cOmplete Tablets, Mini, sans EDTA, Roche) et un cocktail d'inhibiteurs de phosphatase (PhosSTOP EASY Pack, Roche) et la concentration en protéines a été mesurée à l'aide d'un kit de dosage BCA (Thermo Scientific). L'immunotransfert a été effectué en utilisant Cx43 (1: 500, sérum polyclonal, Sigma) et Gapdh (1: 1000, AbCam) a été utilisé comme contrôle de normalisation. Des analyses non recadrées et non traitées de transferts Western sont incluses dans la Fig. 6 supplémentaire.

Les cellules primaires BCEC et bEnd.3 ont été cultivées en monocouches confluentes et les transfections d'ARNsi ont été réalisées selon le protocole du fabricant. Le réactif de transfection TransIT-TKO (Mirus Bio.) a été utilisé pour la plupart des expériences (2 ul/puits d'une plaque à 96 puits) avec 50 nM de concentrations finales d'ARNsi. 100 à 200 ul de volume de réaction total ont été utilisés par puits et incubés dans un incubateur (atmosphère humidifiée à 5 % de CO2, 95 % d'air) à 37 °C. Après environ 72 h après la transfection, les cellules ont été contrôlées visuellement pour l'efficacité de la transfection (en comparant si-Lethal et si-NT) et d'autres expériences ont été menées. À l'exception des siARN de contrôle, nous avons utilisé deux séquences d'ARNsi indépendantes pour chaque gène avec trois répliques chacune. Les siARN utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau supplémentaire 5.

Des souris WT ou Efna2-/- (m) ont été inoculées avec une dose de 105 PFU/souris de LACV (IP). À 3 dpi, ces souris ont reçu une injection rétro-orbitale (intraveineuse; IV) de billes de microsphère modifiées au carboxylate FluoSpheres de 100 nm (Thermo Scientific). Les souris ont été euthanasiées après 30 min. Par anesthésie suivie d'une perfusion transcardiale. Les cerveaux de souris ont été prélevés, traités de manière similaire pour les cryosections. Les cryosections ont été contre-colorées au Hoechst, après réhydratation des lames au PBS. Après le montage, un microscope à épifluorescence Leica DMI 6000B et le logiciel LAS-X ont été utilisés pour capturer les images.

Le 4-PBA (Sigma) et le rec-EFNA2 (Sino Biological) ont été dissous dans un milieu de culture ordinaire pour le traitement des cellules. Le diméthylsulfoxyde (DMSO ; (< 0,5 %)) a été utilisé lorsqu'une matière particulaire a été observée dans la concentration la plus élevée de 4-PBA (10 mM). Suite aux recommandations d'un rapport précédent52, nous avons utilisé une dose maximale de 500 mg/kg-jour et des précautions ont été prises pour éviter la mort d'animaux induite par la toxicité des médicaments. Les souris sevrées (~ 10 g) ont reçu une injection de 4-PBA (500 mg / kg par jour) dissous dans de l'huile de maïs (avec 200 à 300 ul de DMSO / 10 ml) et une injection IP d'environ 200 ul a été administrée quotidiennement. Les souris ont été pesées quotidiennement et le volume d'injection a été ajusté en conséquence. Des souris véhicules ont été injectées de manière similaire avec la solution d'huile de maïs complétée par du DMSO en l'absence de 4-PBA.

Les souris Efna2−/− (m) ou Efna2−/− (s) ont été gracieusement offertes par le professeur David Feldheim (Université de Californie, Santa Cruz). Les souris ont été consanguines et vérifiées pour les génotypes en utilisant la méthode suivante : Les amorces Ephrin A2 sont A2-1 : 5'-CCG CTT CCT CGT GCT TTA CGG TAT C -3', A2-2 : 5'-GGG CCG GTT GCA TTC CCA GCG–3' et A2-3 : 5'-GTG AGC GCT GTG GGT GAT GGC GGC–3' où WT est détecté par A2-2 et A2-3 : 200 pb et le mutant Efna2 est détecté par A2-1 et A2-2 : 500 pb. Les amorces Ephrin A3 sont A3-1 : 5'-GGC TTT TTC TAC AAT CTT TTC TCA - 3', A3-2 : 5'-TCA TGT AGG AGA TAC AGG GC - 3' et A3-3 : 5'-ACC AAA GAA CGG AGC CGG TTG GCG – 3' où WT est détecté par A3-1 et A3-2 : 500 pb et le mutant Efna3 est A3-2 et A3-3 : 200 pb. Les amorces Ephrin A5 sont A5-1 : 5'-AGC CCA GAA AGC GAA GGA GCA AAG C –3', A5-2 : 5'-ATT CCA GAG GGG TGA CTA CCA CAT T –3' et A5-3 : 5' -TCC AGC TGT GCA GTT CTC CAA AAC A –3' où WT est détecté par Wild Type A5-2 et A5-3 : 400 pb et mutant est détecté par A5-1 et A5-3 : 500 pb. Tous ces détails d'amorce ont été partagés avec Transnetyx pour développer un test de génotypage automatisé pour Efna2, Efna3 et Efna5 et les génotypes ont été obtenus à partir d'eux.

Des études d'immunofluorescence ont été réalisées selon un protocole décrit précédemment17. Pour l'immunofluorescence standard, les BCEC primaires ou les cellules bEnd.3 ont été étalées sur une plaque multipuits ou une lame de verre à chambre. Les échantillons ont été fixés à l'aide de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS, suivi d'une perméabilisation des cellules avec du PBS contenant 0,5 % de Triton X-100. Ensuite, les cellules ont été bloquées avec du PBS contenant 5 % de sérum d'âne inactivé par la chaleur et 0,5 % de Triton X-100. Après incubation avec des antisérums primaires (dilués dans une solution de blocage) pendant 1 h (RT) ou pendant une nuit (4 ° C), les anticorps liés de manière non spécifique ont été lavés avec du sérum de blocage. Enfin, les échantillons ont été marqués avec des antisérums secondaires dilués dans une solution de blocage, lavés avec du PBS et incubés avec une coloration de Hoechst pendant 10 min. Les échantillons ont été montés à l'aide de Fluoromount-G (Southern Biotech) et séchés pour durcir à température ambiante dans l'obscurité et stockés à 4 ° C pour une utilisation à long terme ou stockés avec du PBS dans un réfrigérateur à 4 ° C. Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope CX7 (Thermo Scientific) ou d'un microscope confocal inversé Leica DMI8000 (Chicago, IL). Les images et les données de quantification ont été acquises et/ou traitées avec le logiciel Cellomics (machine Cx7), LAS X (Pour microscope confocal et épifluorescence Leica), Fiji (1.52n).ImageJ (1.52a, NIH) ou Imaris 8 (Bitplane, Suisse ) ou le logiciel FlowJo 10.8.1. Les tablettes graphiques Prism 8 et 9 et Microsoft Excel (2010) ont été utilisées.

Les souris ont été perfusées par voie transcardiaque avec du PBS et les cerveaux ont été prélevés. Ensuite, les cerveaux ont été fixés dans du formol tamponné neutre à 10 % (NBF) pendant 24 heures, puis équilibrés dans du saccharose à 10 %, puis du saccharose à 30 %. Après cryoprotection, les cerveaux ont été montés à l'aide du composé Tissue Plus OCT (Fisher HealthCare), congelés et des coupes de 10 um ont été obtenues à l'aide d'un cryotome CM1 950 (Leica Microsystems). Les coupes ont ensuite été colorées avec un anticorps LACV (1:500–1:800) ou un anticorps ZO1 (1:250, Thermo Scientific) en utilisant une méthode précédemment décrite41 avec des modifications mineures. En bref, des coupes de tissus congelés ont été lavées avec de l'éthanol à 95 % glacé, puis avec du PBS à température ambiante (RT) pour éliminer la cryomatrice. Un stylo marqueur hydrophobe a été utilisé pour créer des limites autour des sections. Les lames ont ensuite été lavées avec du PBS (3 fois) et incubées avec du sérum de blocage (PBS avec 0,5 % de Triton X-100 et 5 % de sérum d'âne) à température ambiante. Les coupes ont été incubées pendant une nuit à 4°C avec l'antisérum primaire qui a été dilué dans du sérum bloquant. Les coupes ont été lavées 3 fois avec du PBS et incubées avec un antisérum secondaire dilué dans du sérum bloquant pendant 2 h à température ambiante. Toutes les incubations ont été faites dans une chambre humidifiée. Enfin, après 3 lavages au PBS, les noyaux ont été contre-colorés au Hoechst. Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal inversé Leica DMI8000 (Chicago, IL). Les images ont été traitées avec les logiciels ImageJ (1.52a, NIH), Fiji (1.52n, NIH) ou Imaris 8 (Bitplane, Suisse).

Les surnageants des cultures bEnd.3 infectées et simulées ont été collectés à différents hpi. Les tests de plaque ont été effectués en utilisant une méthode décrite précédemment17. En bref, les monocouches de cellules Vero ont été inoculées avec différentes dilutions de surnageants dans du DMEM additionné de 2 % de FBS et de 1 % de pénicilline/streptomycine. Du MEM contenant 1,5 % de carboxyméthylcellulose (CMC) a été ajouté après 1 h et incubé à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 et à 95 % d'air. A 5 dpi, les cellules ont été fixées à l'aide d'une solution de formol à 10 %, lavées et les plaques ont été visualisées à l'aide d'une solution de cristal violet à 0,35 %.

Les cellules bEnd.3 ont été prélevées à hpi spécifique et la viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide du réactif CellTiter-Glo (Promega), en utilisant le protocole du fabricant. La luminescence a été mesurée à l'aide de FLUOstar Omega (BMG Labtech). En variante, le nombre de cellules a été mesuré à partir du nombre de noyaux (colorés par Hoechst) à l'aide d'un imageur Cx7 (Thermo Scientific).

Les monocouches confluentes de cellules bEnd.3 ont été prérefroidies à 4 ° C et les cellules ont été infectées avec 10 MOI d'inoculum LACV sur de la glace. Les cellules ont été conservées à 4 ° C pendant 2 à 3 h pour permettre aux particules virales de se fixer uniquement à la surface des cellules mais pas de se répliquer à la température réduite. L'inoculum a été retiré avec précaution et les cellules ont été soigneusement lavées (2 à 3 fois) à 4 ° C. Du milieu de culture frais a ensuite été ajouté sur le dessus et les cellules ont été portées à 37°C. Le virus attaché a ensuite été autorisé à s'amplifier dans les cellules à la température accrue jusqu'à 24 hpi et a été analysé pour l'intensité LACV à l'aide d'un test d'immunofluorescence.

Moyenne ± SD ou points de données individuels avec moyenne sont présentés dans chaque expérience. Pour les analyses ARN-seq, un modèle généralisé binomial négatif avec test de signification de Wald a été réalisé. Les valeurs p bilatérales ont été corrigées pour les tests multiples à l'aide de la méthode Benjamini Hochberg. Une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Tukey ou des tests de comparaison multiple de Dunnett sont effectuées en tant qu'analyses post-hoc pour une comparaison de moyenne multiple ou une comparaison de moyenne de contrôle. Plusieurs tests t appariés ou non appariés sont effectués dans des comparaisons à deux groupes ou des analyses de dépistage. Les comparaisons de survie ont été effectuées à l'aide du test Log-rank (Mantel-Cox). Les détails des analyses statistiques sont fournis dans les légendes des figures individuelles.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données RNA-seq ont été déposées auprès du Gene Expression Omnibus (GEO) et sont accessibles au public (GSE217434). Lien hypertexte vers l'ensemble de données : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=Gse217434. Le logiciel SIGNAL est accessible au public en utilisant ce lien hypertexte : https://signal.niaid.nih.gov/. Les souris de type sauvage (RRID : IMSR JAX : 000664 et souche # : 000664) sont disponibles au Jackson Laboratory. Les souris Efna2−/− sont disponibles sur demande au laboratoire du Dr Iain Fraser, NIAID. Les autres ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions le professeur David Feldheim (Université de Californie à Santa Cruz) pour avoir aimablement fait don de souris Efna2−/− (m) et Efna2−/− (s). Nous remercions Samuel Katz, Jing Sun et Sharat Vayttaden pour leur aimable assistance et leur formation pour l'écran transcriptomique, l'écran ciblé siARN et l'imagerie à haut débit, respectivement. Nous remercions l'unité de génomique des laboratoires Rocky Mountain de la branche des technologies de recherche du NIAID pour son aimable assistance avec l'ARN-seq et les analyses de suivi. Nous remercions spécifiquement Stacy Ricklef pour la préparation de la bibliothèque RNA-seq et le traitement des séquences. Nous remercions également le noyau d'imagerie de la branche des technologies de recherche du NIAID pour avoir fourni des installations d'imagerie. Nous reconnaissons et apprécions les gardiens d'animaux et les gestionnaires d'installations du NIAID 14BS pour leur aide dans l'entretien et l'élevage des animaux. Nous remercions également James Striebel, Simote Foliaki, Sinu John, Clinton Bradfield et Julia Gross pour leur lecture critique du manuscrit et les membres du Laboratoire des maladies virales persistantes (LPVD), RML et du Laboratoire de biologie du système immunitaire (LISB), Bethesda pour sa contribution critique et son aide au cours de ce travail. Cette étude a été soutenue par le programme de recherche intra-muros de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses (NIAID), National Institutes of Health (NIH). RB a été soutenu par la bourse RML-Bethesda NIAID.

Financement en libre accès fourni par les National Institutes of Health (NIH).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Karin E. Peterson, Iain DC Fraser.

Section de neuroimmunologie, Laboratoire des maladies virales persistantes, Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH, 903 S. 4th Street, MT, 59840, Hamilton, États-Unis

Rahul Basu, Clayton W. Winkler et Karin E. Peterson

Section des systèmes de signalisation, Laboratoire de biologie du système immunitaire, Institut national des allergies et des maladies infectieuses, Instituts nationaux de la santé, 4 Memorial Drive, Bethesda, MD, 20892, États-Unis

Rahul Basu et Iain DC Fraser

Branche des technologies de recherche, Institut national des allergies et des maladies infectieuses, Instituts nationaux de la santé, 4 Memorial Drive, Bethesda, MD, 20892, États-Unis

Sundar Ganesan

Section de recherche en génomique, Direction des technologies de recherche, Division de la recherche intra-muros, Institut national des allergies et des maladies infectieuses, Instituts nationaux de la santé, 903 S. 4th Street, MT 59840, Hamilton, MT, États-Unis

Sarah L. Anzick et Craig Martens

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RB a réalisé les expériences et rédigé le manuscrit. SG a aidé à l'acquisition, au traitement et à l'analyse des images confocales. CW a réalisé toutes les expériences relatives à l'analyse RNA-seq. SLA et CM ont effectué, analysé et inventorié les données RNA-seq, et ont aidé aux analyses de données de criblage transcriptomique (analyse IPA, préparation de parcelles de volcan, etc.). Le KEP et l'IDCF ont conçu le projet, supervisé les expériences et rédigé le manuscrit. Le KEP et l'IDCF ont contribué à parts égales. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Karin E. Peterson ou Iain DC Fraser.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Tous les auteurs ont approuvé la soumission de ce manuscrit.

Nature Communications remercie Andrew MacLean et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournir un lien vers la licence Creative Commons et indiquer si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Basu, R., Ganesan, S., Winkler, CW et al. Identification des régulateurs de gènes spécifiques à l'âge de la neuroinvasion et de la pathogenèse du virus de La Crosse. Nat Commun 14, 2836 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37833-x

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Reçu : 07 août 2022

Accepté : 03 avril 2023

Publié: 18 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37833-x

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