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Jul 26, 2023

Base structurelle pour la formation de pores GSDMB et son ciblage par IpaH7.8

Nature tome 616, pages

Nature volume 616, pages 590–597 (2023)Citer cet article

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Les gasdermines (GSDM) sont des protéines porogènes qui jouent un rôle essentiel dans la défense de l'hôte par pyroptose1,2. Parmi les GSDM, le GSDMB est unique en raison de son profil distinct de liaison aux lipides et de l'absence de consensus sur son potentiel pyroptotique3,4,5,6,7. Récemment, il a été démontré que GSDMB présente une activité bactéricide directe grâce à son activité de formation de pores4. Shigella, un entéropathogène intracellulaire adapté à l'homme, échappe à cette défense de l'hôte médiée par GSDMB en sécrétant IpaH7.8, un effecteur de virulence qui déclenche la dégradation protéasomique dépendante de l'ubiquitination de GSDMB4. Nous rapportons ici les structures de microscopie électronique cryogénique du GSDMB humain en complexe avec Shigella IpaH7.8 et le pore GSDMB. La structure du complexe GSDMB – IpaH7.8 identifie un motif de trois résidus chargés négativement dans GSDMB comme déterminant structurel reconnu par IpaH7.8. Humain, mais pas de souris, GSDMD contient ce motif conservé, expliquant la spécificité d'espèce de IpaH7.8. La structure des pores GSDMB montre le lieur interdomaine régulé par l'épissage alternatif dans GSDMB en tant que régulateur de la formation des pores GSDMB. Les isoformes de GSDMB avec un lieur interdomaine canonique présentent une activité pyroptotique normale tandis que d'autres isoformes présentent une activité pyroptotique atténuée ou nulle. Dans l'ensemble, ce travail met en lumière les mécanismes moléculaires de la reconnaissance et du ciblage des GSDM par Shigella IpaH7.8 et montre un déterminant structurel dans GSDMB critique pour son activité pyroptotique.

Les protéines Gasdermin (GSDM) consistent en un domaine porogène N-terminal (GSDM-N), un domaine auto-inhibiteur C-terminal (GSDM-C) et un lieur interdomaine7,8,9,10,11,12,13,14 ,15. Le GSDMB humain a plusieurs isoformes d'épissage (isoformes 1 à 6, Q8TAX9; UniProt) variant dans leurs lieurs interdomaines. Les isoformes 1, 4 et 6 contiennent des lieurs interdomaines "canoniques" tandis que les isoformes 2 et 3 contiennent des lieurs tronqués et l'isoforme 5 ne comprend que le domaine C-terminal16. Bien que la question de savoir si le GSDMB induit la pyroptose reste controversée, une étude récente a montré que le GSDMB cible préférentiellement la membrane bactérienne et limite la croissance et la propagation microbiennes directement pendant l'infection4,13. Ce processus, cependant, est renversé par Shigella - une bactérie Gram-négative hautement infectieuse qui provoque une gastro-entérite aiguë17 - grâce à sa protéine effectrice sécrétée, IpaH7.8 (réf. 4). Étonnamment, IpaH7.8 lie également GSDMD en plus de GSDMB. Cependant, IpaH7.8 n'ubiquitine que l'humain, mais pas la souris, GSDMD18, ce qui peut être lié au fait que les humains et les primates non humains sont les réservoirs naturels de Shigella alors que les souris ne le sont pas19. Les mécanismes moléculaires expliquant pourquoi le GSDMB fonctionne distinctement des autres GSDM dans l'induction de la pyroptose, et comment le GSDMB et le GSDMD humain sont spécifiquement reconnus par Shigella IpaH7.8, sont inconnus.

Pour comprendre comment le GSDMB est reconnu par Shigella IpaH7.8, nous avons déterminé la structure en microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) du GSDMB humain (isoforme 1, Q8TAX9-1) en complexe avec Shigella flexneri IpaH7.8 à une résolution globale de 3,8 Å (Données étendues Fig. 1 et Tableau de données étendu 1). La structure montre un complexe 1: 1 avec la liaison du domaine IpaH7.8-LRR à GSDMB-N (Fig. 1a, b). IpaH7.8-LRR s'organise en une structure de solénoïde légèrement incurvée contenant neuf motifs LRR coiffés par deux hélices α N-terminales (α1 et α2) et une hélice α4 C-terminale, ainsi qu'un brin β10 parallèle qui augmente directement le β -feuille de LRR (Fig. 1c). L'architecture globale de IpaH7.8-LRR est très similaire aux structures précédemment rapportées des domaines LRR dans IpaH1.4 et IpaH3 (réfs. 20, 21) (Fig. 1d). La densité du domaine NEL C-terminal IpaH7.8 n'est pas visible sur la carte, probablement en raison de sa flexibilité dans le complexe, permettant l'ubiquitination de plusieurs lysines dans GSDMB4 (Extended Data Fig. 1c).

a, schémas de domaine de IpaH7.8 et GSDMB. Les limites du domaine sont étiquetées. b, Structure globale du complexe GSDMB–IpaH7.8 en deux vues. Le domaine LRR dans IpaH7.8 et les domaines GSDMB-N- et -C-terminaux sont colorés comme dans a. c, diagramme en ruban montrant la structure du domaine IpaH7.8-LRR. d, superposition de IpaH7.8-LRR (saumon) sur les domaines LRR IpaH1.4 (jaune ; PDB : 7V8H) et IpaH3 (cyan ; PDB : 3CVR). e, Structure globale de GSDMB (à gauche) et superposition des structures de GSDMB et GSDMA3 de souris (PDB : 5B5R) (à droite). Le brin β4 dans le GSDMA3 de souris n'est pas observé dans la structure du GSDMB. Les domaines N- et C-terminaux de GSDMA3 sont respectivement colorés en marron et en gris. f, Vue rapprochée de l'interface entre l'hélice α4 GSDMB-N-terminal et GSDMB-C. GSDMB-C est représenté sous forme de potentiels électrostatiques et l'hélice α4 GSDMB-N-terminale sous forme de dessin animé, avec des résidus hydrophobes impliqués dans l'interaction représentés sous forme de bâtons. NT, domaine N-terminal ; CT, domaine C-terminal.

GSDMB adopte une conformation auto-inhibée très similaire à celle de GSDMA3 et GSDMD7,8 (Fig. 1e). Le brin β4 prédit (en référence à la structure GSDMA3) n'a pas été observé dans la densité, alors que l'hélice α4 dépasse du GSDMB-N pour contacter GSDMB-C (Fig. 1e). La résolution locale de GSDMB-C est relativement inférieure à celle du noyau GSDMB-N/IpaH7.8-LRR, indiquant une dynamique entre les domaines N- et C-terminaux de GSDMB (Extended Data Fig. 1c). Malgré sa faible résolution, nous avons pu tracer la chaîne principale de GSDMB-C, qui adopte un faisceau composé de huit hélices similaires aux structures cristallines précédemment déterminées6 (Fig. 1e et Extended Data Fig. 2a). On pensait que GSDMB avait une auto-inhibition réduite dans sa structure pleine longueur en raison (1) de sa capacité à se lier aux phosphates et sulfatides de phosphatidylinositol sans clivage et (2) de son absence de sous-domaine dans GSDMB-C qui est essentiel pour les interactions interdomaines6, 22 (Données étendues Fig. 2b). Dans notre structure, GSDMB-C piège l'hélice GSDMB-N α4 en saillie à travers un gigantesque sillon hydrophobe formé par les hélices α9, α10 et α12 plutôt que par les hélices α9 et α11 apportées par le sous-domaine dans GSDMA3, résultant en une interface interdomaine encore plus grande dans GSDMB (3 020 Å2 surface d'interface totale dans GSDMB contre 2 745 Å2 dans GSDMA3) (Fig. 1e, f). Nous supposons que le GSDMB de pleine longueur pourrait utiliser un mécanisme différent pour la liaison des phospholipides autre que le clivage.

Dans le complexe GSDMB – IpaH7.8, six motifs LRR sur neuf dans IpaH7.8-LRR interagissent avec GSDMB-N, ce qui donne une surface enterrée totale d'environ 1 826 Å2 entre les deux protéines, avec des zones d'interaction clés divisibles en deux patchs, I et II. LRR7 – LRR9 de IpaH7.8 contactent une boucle courte (boucle α1 – β1 ', résidus 15–21) contenant plusieurs résidus chargés négativement dans GSDMB-N pour former le premier patch (I), alors que IpaH7.8-LRR4–6 interagissent avec le brin β3 dans le premier domaine d'extension (ED1)9,23 dans GSDMB formant le deuxième patch (II) (Fig. 2a).

a, Les deux interfaces entre GSDMB et IpaH7.8 sont mises en évidence par des cases en pointillés. b, Interactions détaillées dans le patch d'interface I. Les résidus participant à cette interface sont représentés par des balles et des bâtons ; les liaisons hydrogène sont représentées par des lignes pointillées grises. c, électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) colorée au bleu de Coomassie de réactions d'ubiquitination in vitro utilisant GSDMB (WT et mutants) et IpaH7.8. Résultats représentatifs de trois expériences indépendantes. d, Interactions détaillées dans le patch d'interface II. Les résidus participant à cette interface sont représentés par des balles et des bâtons ; les liaisons hydrogène sont représentées par des lignes pointillées grises. e, SDS – PAGE colorée au bleu de Coomassie de l'ubiquitination in vitro de GSDMB par IpaH7.8 (WT ou mutants). Résultats représentatifs de trois expériences indépendantes. f, Immunoblots de l'ubiquitination de GSDMB dans des cellules HEK293T cotransfectées avec GSDMB marqué FLAG et HA-IpaH7.8 (WT ou mutants). WCL, lysats de cellules entières. Résultats représentatifs de trois expériences indépendantes. g, SDS – PAGE colorée au bleu de Coomassie de l'ubiquitination in vitro de GSDMB ou de GSDMD humain (WT et mutants) par IpaH7.8. Résultats représentatifs de trois expériences indépendantes. h, SDS – PAGE colorée au bleu de Coomassie de l'ubiquitination in vitro de GSDMD de souris (WT et mutants) par IpaH7.8. D17HG et D17AG remplacent la séquence non conservée (S17GSR20) dans le GSDMD de souris par les séquences GSDMD et GSDMB humaines correspondantes, respectivement. L'alignement de la séquence d'acides aminés du motif α1 – β1 '(souligné) entre GSDMB et GSDMD humain et murin est illustré au-dessus de SDS – PAGE. Les séquences échangées entre trois GSDM sont mises en évidence par la boîte rouge. Résultats représentatifs de trois expériences indépendantes. i, j, SDS – PAGE colorée au bleu de Coomassie de réactions d'ubiquitination in vitro utilisant IpaH7.8 et GSDMB (WT et mutants). Le brin ß3 dans GSDMB a été soit muté comme indiqué en i, soit permuté par les séquences correspondantes de GSDMD humain (hß3) et de souris (mß3) en j. Le contrôle en j indiquait l'ubiquitination de WT GSDMB avec le mutant IpaH7.8C357. Résultats représentatifs de trois expériences indépendantes.

Le patch d'interface I est principalement médié par des interactions polaires. En particulier, les chaînes latérales de Q185 et R186 de LRR7, Y207 et H209 de LRR8, et R228, N230 et S232 de LRR9 dans IpaH7.8 forment dix liaisons hydrogène avec E15, D17, A18 et D21 dans GSDMB. Pendant ce temps, les chaînes latérales chargées positivement de R186 et R228 dans IpaH7.8 forment des ponts salins supplémentaires avec les chaînes latérales chargées négativement de E15 et D21, respectivement, dans GSDMB (Fig. 2b). Fait intéressant, les chaînes latérales de E15 et D17 dans GSDMB s'insèrent dans deux petites poches basiques formées par R186 et H209 avec les résidus environnants dans IpaH7.8 (Extended Data Fig. 3a). Les deux poches sont distantes d'environ 10 Å, suggérant un mécanisme potentiel dans lequel IpaH7.8 reconnaît un motif spécifique contenant deux résidus acides à cette distance précise. En effet, des mutations uniques de E15 ou D17 dans GSDMB dans un résidu chargé ou non chargé inversement ont réduit de manière significative ou partielle l'ubiquitination de GSDMB par IpaH7.8 in vitro (Fig. 2c).

Le patch d'interaction II est médié par des liaisons hydrogène et des interactions hydrophobes et de Van der Waals. La chaîne latérale de R125 de IpaH7.8-LRR4 forme deux liaisons hydrogène avec le groupe carbonyle du squelette de E83 et l'oxygène carboxylate OE1 de Q85 dans GSDMB. En parallèle, la chaîne latérale de Y165 de LRR6 forme deux liaisons hydrogène avec le groupe amino de squelette de L87 et le groupe carbonyle de squelette de Q85 dans GSDMB, et Y166 de LRR6 forme une liaison hydrogène avec le groupe carbonyle de squelette de L87 dans GSDMB. De plus, les résidus F143, E145 et N146 dans LRR5, et F161 et H163 dans LRR6 de IpaH7.8, entrent en contact avec le brin GSDMB β3 par le biais d'interactions hydrophobes et de Van der Waals étendues (Fig. 2d).

L'alignement de séquence basé sur la structure montre que les résidus clés dans les deux patchs d'IpaH7.8 sont divergents dans les positions équivalentes dans d'autres protéines de la famille IpaH (Extended Data Fig. 3b), faisant d'IpaH7.8 le membre unique de la famille IpaH qui cible spécifiquement GSDMB4 ,18. Des mutations de résidus clés dans IpaH7.8, tels que R186E, H209G, R228D et R186E/R228D dans le patch d'interface I, et F143S, F161G/I181G, Y165A/Y166A et Y165E/Y166E dans le patch d'interface II, abolissent tous largement ou complètement le capacité de IpaH7.8 à ubiquitiner GSDMB (Fig. 2e). Les mutations de R186E / R228D et Y165E / Y166E atténuent également de manière significative l'ubiquitination médiée par IpaH7.8 et la dégradation de GSDMB dans les cellules (Fig. 2f, Données étendues Fig. 3c et Fig. 1 et 2 supplémentaires).

Il a déjà été démontré que Shigella IpaH7.8 se lie à la fois au GSDMD humain et murin ; cependant, il n'ubiquitine que le GSDMD18 humain. En utilisant la calorimétrie de titration isotherme (ITC), nous avons caractérisé les interactions entre IpaH7.8 et GSDMB/D. IpaH7.8 a montré une affinité 46 fois plus faible pour le GSDMD humain (avec une constante de dissociation (Kd) de 20, 4 ± 1, 8 μM) que pour le GSDMB (Kd = 0, 44 ± 0, 03 μM) (Extended Data Fig. 4a, b). Étonnamment, aucune interaction n'a été détectée entre IpaH7.8 et le GSDMD de souris (Extended Data Fig. 4c). En accord avec leurs affinités, la chromatographie analytique par filtration sur gel a montré qu'IpaH7.8 migrait efficacement avec le GSDMB et migrait partiellement avec le GSDMD humain alors qu'il migrait à peine avec le GSDMD de souris (Extended Data Fig. 4d – f). Nous concluons donc que Shigella IpaH7.8 se lie à la GSDMD humaine mais pas à la souris.

La substitution d'un fragment près de l'extrémité N (résidus 16 à 21) par la séquence humaine a sauvé avec succès la dégradation médiée par IpaH7.8 du GSDMD de souris dans les cellules18. Dans notre structure complexe, ce fragment correspond à la boucle α1 – β1 'de GSDMB dans laquelle un motif de trois résidus chargés négativement (motif α1 – β1 ') interagit de manière extensive avec IpaH7.8 (Fig. 2b). L'alignement de séquence basé sur la structure a montré que ce motif est conservé dans le GSDMD humain mais pas chez la souris (E15MD17AGGD21 dans le GSDMB, E15LD17HGGD21 dans le GSDMD humain et E15VS17GSR20GD22 dans le GSDMD de souris) (Extended Data Fig. 2b). Le GSDMD de souris contient le E15 conservé, mais le second résidu acide est remplacé par une sérine (mS17). Le GSDMD de souris contient également le troisième résidu acide conservé (mD22) mais possède une insertion d'arginine unique en position 20 (mR20) (Extended Data Fig. 2b). La substitution de D17 par une sérine peut perturber son interaction avec Y207 et N230 dans IpaH7.8 alors que l'insertion de mR20 éloigne probablement l'acide aspartique suivant (mD22) de l'interaction avec R228 dans IpaH7.8 (Fig. 2b), bloquant ainsi les interactions entre souris GSDMD et IpaH7.8. En conséquence, une seule mutation avec une insertion d'arginine en position 20 (R20Ins) et une double mutation de D17S / R20Ins dans GSDMB et GSDMD humain ont bloqué leur interaction avec IpaH7.8 et ont ensuite compromis l'ubiquitination médiée par IpaH7.8 (Fig. 2g et Extended Données Fig. 4g, h). D'autre part, le remplacement du motif α1 – β1 'non conservé dans le GSDMD de souris par les résidus correspondants de GSDMB ou de GSDMD humain a sauvé l'ubiquitination du GSDMD de souris par IpaH7.8 (Fig. 2h).

Malgré la caractéristique structurelle similaire, la séquence d'acides aminés des brins β3 dans les GSDM est très divergente (Extended Data Fig. 4i). Nous nous sommes demandé si le brin β3 dans les GSDM fonctionnait comme un autre déterminant structurel pour la reconnaissance par IpaH7.8. Cependant, le brin β3 dans GSDMB interagit avec IpaH7.8 principalement via son squelette, indiquant un mode d'interaction indépendant de la séquence. En accord avec notre hypothèse, les mutations du brin β3 de GSMDB n'ont pas affecté l'ubiquitination (Fig. 2i). De plus, l'échange de brins β3 entre GSDMB, GSDMD humain et un mutant GSDMD de souris hébergeant une mutation de sauvetage (D17HG) n'a pas affecté leur ubiquitination (Fig. 2j et Extended Data Fig. 4j). Nous concluons donc que le motif à trois résidus chargés négativement dans la boucle α1 – β1 'est le déterminant structurel des GSDM.

Comme le brin β3 est un élément essentiel de la formation des pores du GSDM8,9,23, nous avons ensuite testé si la liaison de IpaH7.8 à ce brin inhibe directement la formation des pores du GSDMB. Comme prévu, le GSDMB clivé par le granzyme A (GZMA) a provoqué une fuite rapide du colorant 6-carboxyfluorescéine (6-FAM) des liposomes contenant de la cardiolipine (CL) 4 (Fig. 3a), indiquant la formation de pores GSDMB. Cette fuite de liposome induite par GSDMB a été largement inhibée en présence d'IpaH7.8, alors qu'aucune inhibition significative n'a été observée lorsque GSDMB a été incubé avec IpaH7.8Y165E/Y166E ou IpaH7.8R228D/R186E, deux mutants IpaH7.8 qui n'interagissent plus avec GSDMB (Fig. 3a et données étendues Fig. 5a). IpaH7.8C357A, un mutant catalytiquement inactif qui se lie toujours à GSDMB4, 18, a également atténué la fuite de liposome induite par GSDMB (Fig. 3a). Le titrage de la concentration a en outre démontré qu'IpaH7.8 inhibait l'activité du GSDMB de manière dose-dépendante, avec une concentration inhibitrice semi-maximale (IC50) de 1, 46 ± 0, 11 μM (Fig. 3b et Extended Data Fig. 5b). IpaH7.8 n'a pas affecté le clivage de GSDMB, mais a directement inhibé la liaison de GSDMB-N aux liposomes (Extended Data Fig. 5c). Fait intéressant, IpaH7.8 n'a pas inhibé la fuite de liposomes causée par le GSDMD humain clivé par la caspase-11 (Extended Data Fig. 5d). L'association de GSDMD-N humain avec des liposomes n'a été inhibée que par de très fortes concentrations d'IpaH7.8 (Extended Data Fig. 5e).

a, La capacité de GSDMB à induire une fuite de liposomes contenant du CL (CL-liposomes) lorsqu'il est incubé avec IpaH7.8 (WT ou mutants indiqués). b, Courbe dose-réponse d'IpaH7.8 dans l'inhibition de l'activité de formation de pores de GSDMB dans un test de fuite de liposomes. La pente initiale de l'augmentation de la fluorescence (RU min–1) a été tracée par rapport au logarithme de la concentration d'IpaH7.8 pour déterminer l'IC50 d'IpaH7.8. RU, unité relative de fluorescence. a,b, chaque point représente la moyenne ± sd de trois répétitions techniques. c, inhibition de la destruction bactérienne médiée par le GSDMB par IpaH7.8. WT : type sauvage ; AA : Y165E/Y166R ; AR : R186E/R228D. Barres d'erreur, moyenne ± sd de trois expériences indépendantes. *P < 0,05, **P < 0,005, ***P < 0,0005. Analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test post hoc de Tukey par rapport au témoin tampon. d, test de sédimentation des liposomes montrant l'association de GSDMB ubiquitiné et non ubiquitiné avec des CL-liposomes. Les surnageants et les culots (liposomes) ont été analysés par SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie. FL, pleine longueur. e, Effet de l'ubiquitination sur l'inhibition des activités de formation de pores du GSDMB dans l'induction de la libération de fluorescence à partir des CL-liposomes. Chaque point représente la moyenne ± sd de trois répétitions techniques. f, les lysines au niveau de la région transmembranaire, les interfaces de liaison aux lipides et d'oligomérisation à la fois dans le GSDMB et le GSDMD humain sont présentées. g, SDS – PAGE colorée au bleu de Coomassie de l'ubiquitination in vitro de mutants GSDMB ne contenant pas de lysine (allKR) ou une seule lysine (comme indiqué). Résultats représentatifs de trois expériences indépendantes. h, Surveillance des activités de formation de pores des mutants GSDMB ubiquitinés de g en utilisant des CL-liposomes. Les mesures de fluorescence ont été prises au point temporel de 30 min. Les résultats représentent la moyenne ± écart-type de trois répétitions techniques. i, Suivi de l'activité porogène du mutant GSDMB3R ubiquitiné. GSDMB3R : K177/K190/K192 sont mutés en arginines dans GSDMB. Chaque point représente la moyenne ± sd de trois répétitions techniques.

Parce que GSDMB possède une activité microbicide directe par reconnaissance de phospholipides spécifiques sur la membrane bactérienne4, nous avons ensuite examiné si IpaH7.8 inhibe directement l'activité antibactérienne de GSDMB. Nous avons constaté qu'environ 50 % d'Escherichia coli DH5α étaient tués lorsqu'ils étaient exposés au GSDMB clivé par GZMA, alors que la viabilité bactérienne était significativement sauvée par l'ajout d'IpaH7.8 de type sauvage (WT) mais pas par les mutants IpaH7.8Y165E/Y166E et IpaH7. .8R186E/R228D. GSDMB pleine longueur ou IpaH7.8 seuls n'ont montré aucun effet sur la croissance bactérienne (Fig. 3c). Ces observations suggèrent que IpaH7.8 est un inhibiteur direct de GSDMB.

L'ubiquitination médiée par IpaH7.8 elle-même était insuffisante pour empêcher le GSDMD de s'associer aux membranes18 (Extended Data Fig. 5f). L'inhibition de la pyroptose médiée par GSDMD par IpaH7.8 repose sur la dégradation ultérieure du protéasome18. Conformément à ce rapport, notre test de fuite de liposomes a montré une activité de GSDMD humain ubiquitiné comparable à celle non ubiquitinée (Extended Data Fig. 5g). De manière inattendue, cependant, le GSDMB ubiquitiné a presque complètement perdu sa capacité à s'associer aux liposomes et son activité de formation de pores pour induire une fuite de liposomes (Fig. 3d, e).

Nous nous sommes ensuite demandé quelles lysines dans GSDMB-N sont responsables de l'inhibition médiée par l'ubiquitination de l'activité de formation de pores. Le GSDMB contient 31 lysines dont 16 dans le domaine porogène alors qu'il n'y a que 15 lysines dans le GSDMD humain, dont 12 dans le domaine porogène. Parmi ces lysines, K14 est unique dans le GSDMB et se localise sur l'extrémité C-terminale de l'hélice α1, une région impliquée dans l'assemblage des pores du GSDM9,23, et K43 se situe près de l'interface de liaison aux lipides. L'ubiquitination de K14 et K43 peut affecter l'oligomérisation du GSDMB-N et la liaison aux lipides. K102, K177, K190 et K192 se localisent dans la région transmembranaire et sont conservés à la fois dans GSDMB et GSDMD ; cependant, ils sont enfouis plus profondément dans la membrane dans GSDMB que dans GSDMD (Fig. 3f et Extended Data Fig. 6). L'ubiquitination de ces résidus peut affecter l'insertion membranaire du GSDMB. Pour examiner expérimentalement ces possibilités, nous avons généré une construction GSDMB avec toutes les lysines mutées en arginines (mutant allR) et des constructions possédant soit une seule lysine (K14, K102 ou K177) soit deux lysines (K190/K192). Le test d'ubiquitination in vitro a montré que toutes ces constructions GSDMB déclenchaient l'activation de l'activité E3 ligase de IpaH7.8, indiquant le repliement correct de ces mutants et leur capacité à se lier à IpaH7.8 (réf. 24) (Fig. 3g, poly-Ub ). Cependant, seuls GSDMBK177 et GSDMBK190/K192 ont été ubiquitinés par IpaH7.8 (Fig. 3g, disparition de GSDMB-FL par rapport aux apports). De manière correspondante, les mutants ubiquitinés GSDMBK177 et GSDMBK190 / K192 ont montré des activités significativement atténuées dans l'induction de la fuite des liposomes (Fig. 3h). Ensuite, nous avons muté les trois lysines (K177, K190 et K192) dans WT GSDMB (mutant 3R) et testé l'effet sur l'ubiquitination et l'activité de formation de pores. Le mutant GSDMB3R subissait toujours une ubiquitination par IpaH7.8, indiquant l'existence d'autres sites d'ubiquitination dans GSDMB4, 18 (Extended Data Fig. 5h). Cependant, le GSDMB3R ubiquitiné possédait une activité de formation de pores comparable à celle non ubiquitinée (Fig. 3i). Collectivement, nous concluons que l'ubiquitination de GSMDB par IpaH7.8 à K177, K190 et K192 est suffisante pour inhiber son activité de formation de pores sans nécessiter de dégradation protéasomique.

Malgré son activité bactéricide directe4, on ne sait toujours pas si le GSDMB induit une pyroptose. Nous avons remarqué que les lieurs interdomaines dans cinq isoformes de GSDMB humain (isoformes 1 à 4 et 6) varient à la fois en longueur et en séquence25 (Fig. 4a et Extended Data Fig. 6). Le lieur ne participe pas à l'interaction GSDMB – IpaH7.8 (Fig. 1e), et les cinq isoformes de GSDMB ont été également ciblées par IpaH7.8 pour l'ubiquitination et l'inhibition (Extended Data Fig. 7a, b); le lieur n'affecte pas non plus le clivage de GZMA (Extended Data Fig. 7c). Au contraire, le lieur peut jouer un rôle dans la régulation de l'activité de formation de pores GSDMB3. Des études antérieures ont montré que les isoformes 4 et 6 de GSDMB contenant la séquence canonique dans le lieur interdomaine présentaient de fortes activités de perméabilisation de la membrane à la fois in vitro et dans les cellules5,7, alors que l'isoforme 2, qui n'a pas la séquence canonique, n'a pas d'activité pyroptotique3. De manière surprenante, l'isoforme 1, contenant également la séquence canonique dans son lieur interdomaine, n'induit pas la mort cellulaire pyroptotique ; il cible plutôt les membranes bactériennes pour tuer les bactéries4. De manière cohérente, nous avons constaté que les cellules transfectées avec le domaine N-terminal des isoformes 4 ou 6, mais pas celui des isoformes 1, 2 ou 3, présentaient une mort cellulaire pyroptotique marquée par rapport aux cellules transfectées avec des GSDMB pleine longueur (Fig. 4b et Données étendues Fig. 7d). Fait intéressant, la mort cellulaire pyroptotique médiée par l'isoforme 4 était significativement inhibée lorsqu'elle était coexprimée avec Shigella IpaH7.8. Cette inhibition était indépendante de l'activité E3 ligase de IpaH7.8 (données étendues Fig. 7e, f), confirmant en outre que la liaison à IpaH7.8 avait directement inhibé l'activité de formation de pores de GSDMB. Pour examiner plus en détail les activités de formation de pores des isoformes de GSDMB contre les membranes plasmiques de mammifères in vitro, nous avons effectué un test de fuite des liposomes à l'aide de liposomes contenant 10 % de phosphatidylsérine (PS). Nos résultats ont montré que les isoformes 4 et 6 présentaient de fortes activités de perméabilisation vis-à-vis des liposomes PS, tandis que les isoformes 2 et 3 ne présentaient pas d'activité de perméabilisation de la membrane (Fig. 4c). Des résultats similaires ont également été observés pour les liposomes comprenant des extraits lipidiques polaires de foie (Fig. 4d). Fait intéressant, l'isoforme 1 ne présentait que 20 à 40% d'activité de formation de pores par rapport aux isoformes 4 et 6 (Fig. 4c, d). La faible activité perméabilisante de l'isoforme 1 de GSDMB est probablement insuffisamment forte pour surmonter les efforts de réparation membranaire par la machinerie cellulaire, y compris ESCRT-III26, pour induire la pyroptose, alors qu'elle est suffisante pour tuer les bactéries dépourvues de mécanismes de réparation membranaire, bien que la toxicité de l'isoforme 1 pour les bactéries était légèrement plus faible que celle des isoformes 4 et 6 (Extended Data Fig. 7g). Ces données indiquent que les isoformes de GSDMB variant dans leurs lieurs interdomaines présentent des activités de formation de pores distinctes.

a, schéma des isoformes de GSDMB 1 à 4 et 6. Les séquences d'acides aminés (aa) des lieurs interdomaines sont présentées. Les séquences canoniques sont colorées en orange et soulignées, les trois résidus chargés positivement qui interviennent dans la liaison des lipides sont surlignés en bleu et le site de clivage GZMA est marqué. L'isoforme 5 n'est pas représentée car elle ne contient pas le domaine porogène N-terminal. b, cytotoxicité des isoformes de GSDMB, mesurée par le test de double coloration Hoechst/iodure de propidium (PI) dans des cellules HEK293T transfectées de manière transitoire. Barres d'erreur, moyenne ± sd de trois expériences indépendantes. ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey. ****P < 0,00001. c, d, Suivi des activités porogènes des isoformes purifiées de GSDMB à l'aide de liposomes contenant 10 % de PS (c) et de liposomes comprenant des extraits lipidiques polaires vivants (d). Chaque point représente la moyenne ± sd de trois répétitions techniques.

Pour répondre à la question de savoir pourquoi les isoformes de GSDMB présentent des activités de formation de pores distinctes, nous avons cherché à déterminer la structure cryo-EM du pore de GSDMB. Bien que les isoformes GSDMB 1, 4 et 6 aient formé des pores de taille et de forme similaires, ceux de l'isoforme 1 présentaient moins d'agrégation que ceux des isoformes 4 et 6, et les pores de l'isoforme 1 étaient répartis uniformément sur les grilles cryo-EM (Extended Data Fig. 8a,b). Nous avons donc soumis l'isoforme 1 de GSDMB à une analyse cryo-EM. La classification tridimensionnelle (3D) de l'ensemble de données cryo-EM collectées a donné une classe majeure de pores de barillet β GSDMB, une classe d'anneaux sans barillet β représentant des prépores et d'autres classes représentant des états intermédiaires de transition prépore-pore GSDMB9,23 ( Données étendues Figures 8c et 9a,b). Le pore GSDMB s'est avéré être symétrique de 24 à 26 fois (Fig. 5a). Le raffinement 3D du pore symétrique 24 fois a conduit à une carte finale à une résolution globale de 4, 96 Å, tandis que le raffinement de la mise au point a amélioré la résolution locale du domaine globulaire à 4, 48 Å (données étendues Fig. 8c, d et tableau de données étendu 1), nous permettant de construire un modèle atomique du pore GSDMB en utilisant la structure de GSDMB dans le complexe de GSDMB/IpaH7.8 comme modèle de départ.

a, diagramme en ruban de la structure de pores de l'isoforme 1 du GSDMB à 24 sous-unités ajustée à sa carte de densité cryo-EM. TM, transmembranaire. b, Structure d'une sous-unité GSDMB dans sa conformation de pores adaptée à la carte cryo-EM. c, Trois sites de liaison aux lipides (BS1–3) dans GSDMB sont représentés, situés respectivement en α1 et dans les boucles β1–β2 et β7–β8. Les résidus impliqués dans la liaison des lipides sont marqués. d–f, diagramme montrant comment le GSDMD humain (d), l'isoforme GSDMB 1 (e) et les isoformes GSDMB 4 et 6 (f) s'ancrent sur les membranes. Les lieurs interdomaines dans les GSDM sont mis en évidence par les couleurs affichées. Les résidus chargés positivement marqués dans le lieur interdomaine forment un site de liaison aux lipides supplémentaire (BS4). L'isoforme 1 de GSDMB ne conserve qu'un seul résidu chargé positivement dans le lieur interdomaine en raison d'une insertion de quatre acides aminés. g, Surveillance des activités de formation de pores de GSDMB isoforme 4 (à gauche) et de GSDMD humain (hGSDMD, à droite) par dosage de fuite de liposomes. BS4 : triples mutations des trois résidus basiques (R225/K227/K229 dans GSDMB isoforme 4 et K235/K236/R238 dans hGSDMD) en acides glutamiques. GSDMB isoforme 4 et hGSDMD ont été clivés par GZMA et la caspase-11 active, respectivement. Chaque point représente la moyenne ± sd de trois répétitions techniques. h, effet de BS4 de l'isoforme 4 de GSDMB et de hGSDMD sur l'induction de la mort cellulaire pyroptotique dans les cellules HEK293T, tel que contrôlé par le test de double coloration Hoechst/PI. NT, domaine N-terminal ; NTBS4, domaine N-terminal hébergeant la mutation BS4. Barres d'erreur, moyenne ± sd de trois expériences indépendantes. ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey, **P < 0,005, ****P < 0,00005.

Le pore 24 fois GSDMB a un diamètre intérieur estimé de 150 Å, un diamètre extérieur de 250 Å et une hauteur de 60 Å (Fig. 5a), très similaire au pore 27 fois GSDMA3 mais beaucoup plus petit que le pore 31 fois GSDMD9 ,23. Semblable à celle de GSDMA3 et GSDMD, chaque sous-unité de pore GSDMB comprend un domaine globulaire («paume») et deux épingles à cheveux β insérées («doigts») générées à partir de résidus dans les domaines d'extension 1 et 2 (ED1 et ED2, respectivement) dans le GSDMB auto-inhibé pleine longueur (Fig. 5b et données étendues Fig. 9c). L'analyse du pore GSDMB a montré des interfaces d'oligomérisation conservées précédemment observées dans GSDMA3 et GSDMD9,23. L'oligomérisation des pores GSDMB est médiée à la fois par les brins β insérés dans la région transmembranaire et par les domaines globulaires cytosoliques (données étendues Fig. 9d). L'interaction dans la région transmembranaire est apportée par les résidus longeant les brins β3 et β8 voisins entre les sous-unités (données étendues Fig. 9d). L'interaction dans les domaines globulaires adjacents contient principalement des résidus de l'hélice α3 d'une sous-unité interagissant avec la région autour de α2 et β11 de sa sous-unité voisine (Extended Data Fig. 9d); et l'hélice α1 d'une sous-unité juxtaposant l'extrémité avec l'hélice α1 de la sous-unité suivante par le biais de liaisons hydrogène et d'interactions hydrophobes (données étendues Fig. 9d). Ces interactions conservées suggèrent un mécanisme d'oligomérisation unifié dans la famille GSDM, malgré leur variabilité dans la stoechiométrie d'assemblage.

Des études antérieures ont identifié l'hélice α1 N-terminale (« pouce », site de liaison 1 (BS1)), la boucle β1–β2 avec une pointe hydrophobe flanquée de résidus chargés positivement (« poignet », site de liaison 2 (BS2)) dans le domaine globulaire GSDM et un site de liaison aux lipides chargé positivement (site de liaison 3 (BS3)) présent sur l'épingle à cheveux β7 – β8 insérée dans la membrane en tant qu'éléments structurels pour la liaison aux lipides8,9,23. Comme prévu, les trois sites de liaison sont conservés dans GSDMB (Fig. 5c). BS1 et BS2 contiennent des résidus basiques de R10 et K14 dans l'hélice α1 et K43, R44 et R50 dans la boucle β1–β2 interagissant avec les groupes de tête lipidiques acides, et des résidus hydrophobes de F46 et F47 dans l'insertion de la pointe hydrophobe de la boucle β1–β2 dans la bicouche lipidique en tant qu'ancre membranaire, tandis que BS3 est médiée par les résidus basiques de R174 et R195 dans β7 et β8 (Fig. 5c).

Nous avons ensuite examiné l'éditeur de liens interdomaine. Dans le pore GSDMD humain, la densité de l'ensemble du lieur interdomaine (V229 – Q241) est visible (Extended Data Fig. 9e). Les premiers résidus du lieur interdomaine dans GSDMD (région 1 : V229 – F232) sont nécessaires pour l'oligomérisation des pores8 (Extended Data Figs. 6 et 9e). La mutation de la région correspondante dans les isoformes 1 et 4 de GSDMB ('AGLD' dans l'isoforme 1 et 'NIHF' dans l'isoforme 4 en 'GGGG', respectivement) a nettement compromis leurs activités de formation de pores (Extended Data Fig. 9g, h), indiquant un rôle similaire de la région 1 dans GSDMB. La séquence suivante (région 2 : P233-Q241 dans le GSDMD humain) dans le lieur interdomaine n'était pas considérée comme un élément structurel impliqué dans la formation des pores auparavant8,9,23. Étonnamment, la densité de la région 2 dans le pore GSDMB est également visible, quelle que soit la résolution relativement plus faible (Extended Data Fig. 9f). Nous avons suggéré que la région 2 peut être stabilisée par certaines interactions dans le pore. La région 2 du GSDMD humain contient trois résidus basiques avec leurs chaînes latérales chargées positivement pointant vers la membrane, formant probablement un site de liaison aux lipides supplémentaire (BS4) pour la fixation à la membrane (Fig. 5d). Le lieur interdomaine canonique dans GSDMB contient également des résidus basiques dans la région 2 (Fig. 4a et Extended Data Fig. 6). Cependant, un seul résidu basique (R229) est structurellement conservé dans le pore de l'isoforme 1 du GSDMB. En raison d'une insertion de quatre acides aminés (222AGLD225) dans le lieur interdomaine, le résidu en première position (P1) est remplacé par un D225 chargé négativement (Fig. 5e). La substitution par un résidu acide à cette position affaiblit probablement l'attachement membranaire en repoussant la surface membranaire acide, atténuant ainsi l'activité de formation de pores de l'isoforme GSDMB 1. Les modèles atomiques générés d'autres isoformes GSDMB couvrant l'ensemble des lieurs interdomaines, basés sur la structure de l'isoforme 1 et avec l'aide de la prédiction AlphaFold27, montrent que les isoformes 4 et 6 sont structurellement conservées dans le GSDMD humain et préservent les trois résidus basiques, R225, K227 et K229 (Fig. 5f). En revanche, l'isoforme 3 avec un lieur interdomaine tronqué préserverait probablement l'interface d'oligomérisation mais n'a pas le cluster de base pour la liaison lipidique, et l'isoforme 2 n'a pas le lieur interdomaine entier pour l'oligomérisation et la liaison lipidique. Une étude récente montrant que les isoformes de GSDMB sans l'exon 6, qui code la séquence canonique dans le lieur interdomaine, n'induisait pas de pyroptose soutient fortement notre modèle3.

La triple mutation de R225E/K227E/K229E dans le lieur interdomaine de l'isoforme GSDMB 4 a significativement compromis son activité pour induire une fuite de liposomes in vitro (Fig. 5g) et pour médier la mort cellulaire pyroptotique (Fig. 5h et Extended Data Fig. 9i), confirmant le rôle critique de BS4 dans la médiation de la formation des pores GSDMB. Des résultats similaires ont également été observés lorsque nous avons muté les résidus correspondants dans le GSDMD humain (Fig. 5g, h et Extended Data Fig. 9j). Collectivement, nous concluons que le lieur interdomaine est l'élément structurel clé régulant l'activité pyroptotique des isoformes de GSDMB, par la médiation de l'oligomérisation des pores et la fourniture d'un site de liaison lipidique supplémentaire.

Nos structures cryo-EM du complexe GSDMB – IpaH7.8 et du pore GSDMB démontrent les mécanismes structurels sous-jacents à la reconnaissance du GSDMB par l'effecteur bactérien et l'activité pyroptotique du GSDMB, respectivement.

La structure du complexe GSDMB – IpaH7.8 identifie un motif de trois résidus chargés négativement dans la boucle N-terminale α1 – β1 'dans GSDMB et GSDMD humain comme déterminant structurel spécifiquement reconnu par Shigella IpaH7.8. IpaH7.8 ne se lie pas au GSDMD de souris, dans lequel le motif α1 – β1 'n'est pas conservé, ce qui empêche Shigella d'établir efficacement une infection chez la souris. Auparavant, il a été rapporté que IpaH7.8 liait le GSDMD de souris à une affinité encore plus forte que le GSDMD18 humain, ce qui est incompatible avec nos résultats. Cet écart peut être attribué aux différentes méthodes utilisées. La méthode de thermophorèse à micro-échelle utilisée dans cette étude précédente nécessite le marquage de la protéine avec des colorants fluorescents hydrophobes, ce qui peut modifier le comportement de la protéine, conduisant à des résultats confondants28,29. Alternativement, la méthode ITC que nous avons utilisée ici mesure de manière fiable l'affinité de liaison des protéines dans leur état natif sans nécessiter d'étiquetage30. Ceci est également soutenu par nos expériences de mutagenèse et un rapport d'étude récent31.

Notre étude démontre une inhibition très efficace de GSDMB par IpaH7.8 : la liaison de IpaH7.8 à GSDMB a directement empêché son association avec la membrane. De plus, l'ubiquitination ultérieure de GSDMB par IpaH7.8, lorsque Shigella détourne le système d'ubiquitination de l'hôte, inhibe davantage l'activité de GSDMB. Cette inhibition est médiée par l'ubiquitination de trois lysines dans la deuxième épingle à cheveux transmembranaire de GSDMB. L'ubiquitination affecte probablement l'insertion membranaire du GSDMB, inhibant ainsi son activité porogène. Cette inhibition à plusieurs volets du GSDMB par IpaH7.8 confère à Shigella un moyen très efficace d'échapper à l'attaque des lymphocytes cytotoxiques et des cellules tueuses naturelles pendant l'infection5, favorisant la survie bactérienne dans la niche réplicative de l'hôte.

La structure cryo-EM du pore GSDMB illustre un mécanisme unique régulé par un lieur interdomaine d'oligomérisation des pores et de liaison lipidique. GSDMB est largement exprimé dans divers types de cellules et tissus5,32,33, où ses isoformes avec des lieurs interdomaines distincts peuvent être régulés de manière différentielle. De telles différences dans l'expression et les activités des isoformes de GSDMB représentent probablement une stratégie de l'hôte pour affiner les résultats spécifiques au type de cellule de l'activation de GSDMB. Par exemple, les isoformes pyroptotiques de GSDMB sont dominantes dans les cellules épithéliales et sont responsables de l'élimination de la niche réplicative des pathogènes intracellulaires par induction de la pyroptose dans les cellules infectées, alors que l'isoforme non pyroptotique 1 peut être dominante dans les macrophages ou les cellules dendritiques où elle cible et tue bactéries cytosoliques - plutôt que d'induire une pyroptose - assurant ainsi la survie de ces cellules présentatrices d'antigène pour l'activation des lymphocytes T. Actuellement, la distribution, l'abondance et la fonction spécifiques aux cellules de chaque isoforme de GSDMB ne sont pas bien comprises. La pertinence physiologique des isoformes de GSMDB pour l'immunité antibactérienne nécessite une enquête plus approfondie.

GSDMB et GSDMD sont généralement importants en ce qui concerne l'immunité innée contre les agents pathogènes bactériens. Cependant, un agent pathogène tel que Shigella interférant avec GSDMB et GSDMD chez l'homme minimise leur contribution à la défense de l'hôte, expliquant pourquoi les humains sont sensibles à Shigella alors que les souris, qui manquent de GSDMB et dont le GSDMD n'est pas sensible à IpaH7.8, présentent une résistance4,18. Il convient de noter que les personnes atteintes de shigellose se rétablissent généralement en 5 à 7 jours sans avoir besoin d'antibiotiques34, ce qui suggère que GSDMB et GSDMD, bien que ciblés par IpaH7.8, pourraient encore jouer un rôle en rendant Shigella infectieuse pour l'homme.

En plus de l'infection bactérienne, le GSDMB est associé à divers cancers. Une étude récente a indiqué que l'expression de l'isoforme 2 non pyroptotique était plus élevée que celle des autres isoformes chez les patientes atteintes d'un cancer du sein3. La régulation à la hausse des isoformes 2 et 3 peut favoriser la tumorigenèse et les métastases, entraînant une faible survie globale des patients, alors qu'une expression élevée de l'isoforme pyroptotique 4 a l'effet inverse3. Compte tenu de cette association potentielle entre les isoformes de GSDMB et la survie au cancer, d'autres études sont nécessaires pour déterminer si les cellules cancéreuses exploitent l'expression différentielle des isoformes de GSDMB pour résister aux attaques des lymphocytes cytotoxiques.

Les séquences codantes des GSDM pleine longueur ont été clonées dans un vecteur pET28-His-SUMO après l'étiquette His6-SUMO N-terminale. En ce qui concerne la construction GSDMB utilisée pour la détermination structurale cryo-EM, un site de protéase (3C) du rhinovirus humain 3C (LEVLFQ/GP) a été inséré après le résidu K239. La séquence codante de S. flexneri IpaH7.8 a été clonée dans un vecteur pET26b avec une étiquette 6XHis C-terminale et clonée dans un vecteur pET22b sans étiquette d'affinité pour la coexpression avec GSDMB. La caspase-11 (96–373) a été clonée dans un vecteur pET22b pour purifier la forme active du complexe p20–p10. Pour les expériences cellulaires, les GSDM (pleine longueur) et GSDM-N ont été clonés dans un vecteur pcDNA3.1 dans lequel une étiquette FLAG a été fusionnée à l'extrémité C tandis que IpaH7.8 a été inséré dans un vecteur pCMV-HA, résultant en un protéine de fusion avec une étiquette HA N-terminale. Toutes les mutations de cette étude ont été introduites à l'aide du kit de mutagenèse dirigée QuikChange (Stratagene) ou du Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs), et tous les plasmides ont été vérifiés par séquençage.

Pour obtenir le complexe GSDMB-IpaH7.8, des cellules E. coli BL21 (DE3) hébergeant les plasmides d'expression de pET28-His-SUMO-GSDMB et pET22b-IpaH7.8 ont été cultivées dans un bouillon de lysogénie additionné de 50 µg ml-1 de kanamycine et 100 µg ml–1 ampicilline à 37 °C. L'expression des protéines a été induite par l'ajout de 0, 5 mM d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside à 20 ° C pendant 16 h lorsque la densité optique (OD600) a atteint 0, 8. Les cellules ont été recueillies par centrifugation à 5 000 g pendant 20 min. Les cellules récoltées ont été lysées par sonication dans un tampon contenant du Tris-HCl 25 mM pH 8,0, du NaCl 150 mM, du β-mercaptoéthanol 2 mM et de l'imidazole 25 mM. Les lysats ont été centrifugés à 18 000 g et 4 ° C pendant 30 min pour éliminer les fractions insolubles. Les surnageants contenant les protéines recombinantes ont été purifiés en utilisant de l'agarose Ni-NTA (Qiagen) selon les instructions du fabricant. L'élimination de l'étiquette His6-SUMO a été effectuée sur une colonne Ni-NTA à 4 ° C pendant une nuit avec l'ajout de l'Ulp1 recombinant. Les protéines non marquées en circulation ont été purifiées davantage à l'aide d'une colonne échangeuse d'ions Hitrap Q HP (Cytiva), puis d'une colonne d'exclusion de taille Superdex Augmentation 200 (10/300) (Cytiva) dans un tampon contenant 25 mM HEPES pH 7,5 et 150 mM NaCl. Toutes les protéines purifiées ont été confirmées par coloration au bleu de Coomassie de SDS-PAGE.

Des protocoles similaires ont été appliqués pour l'expression et la purification de tous les GSDM individuels, IpaH7.8 et leurs mutants, sauf que l'étiquette His6-SUMO a été conservée pour les GSDM utilisés dans le test d'ubiquitination in vitro. Toutes les protéines purifiées ont été concentrées à environ 5–10 mg ml–1 avant utilisation.

Le plasmide GZMA pET26b-GZMA était un aimable cadeau de J. Lieberman35. Les plasmides de E1 (pET21d-hUbE1), E2 (pET15-hUbE2D2) et d'ubiquitine (pET15-Ub) étaient des cadeaux aimables de C. Wolberger, W. Harper et R. Klevit, respectivement36,37,38. L'expression et la purification ont suivi les protocoles précédents.

Les réactions d'ubiquitination in vitro ont été réalisées dans du tampon A (HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 50 mM, DTT 0,1 mM, MgCl2 10 mM et ATP 5 mM). Les composants ont été mélangés comme indiqué à des concentrations de 0,4 µM E1 (UbE1 humain), 2 µM E2 (UbE2D2 humain), 10 µM E3 (mutant IpaH7.8WT ou IpaH7.8C357A), 200 µM ubiquitine et 10 µM GSDM (WT ou mutants indiqués ). Les réactions ont été incubées à 37 ° C pendant 2 h et arrêtées par l'ajout de colorant de chargement SDS – PAGE, suivie d'une ébullition pendant 5 min avant l'électrophorèse. L'ubiquitination a été évaluée par coloration au bleu de Coomassie de SDS-PAGE.

Le test de fuite des liposomes a été effectué selon un protocole établi9. En bref, la 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine et PS ou CL (Avanti Polar Lipids) ont été mélangés au rapport indiqué dans un tube en verre. Le solvant chloroforme a été évaporé sous un courant d'azote gazeux pendant 30 min. Le film lipidique sec a ensuite été réhydraté avec du tampon B (HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 150 mM) additionné de 6-FAM 50 mM (Tokyo Chemical Industry). Les liposomes chargés en 6-FAM ont ensuite été extrudés à travers une membrane de 1 μm (Whatman Nuclepore) à l'aide d'une mini-extrudeuse (Avanti Polar Lipids). Pour éliminer le 6-FAM non encapsulé, les liposomes extrudés ont été soumis à une colonne de dessalement PD-10 (Cytiva) équilibrée avec du tampon B. Pour le test de fuite des liposomes, les liposomes ont été incubés avec des protéines de GSDMB/D et/ou IpaH7.8 avec ou sans enzymes activatrices (GZMA pour GSDMB et caspase-11p10/p20 pour GSDMD). Les réactions ont été effectuées sur une plaque à 384 puits, avec libération de colorant 6-FAM contrôlée par fluorescence à 517 nm à l'aide d'un lecteur de plaque SpectraMax M5 (Molecular Devices) avec excitation à 495 nm pendant 60 min à des intervalles de 1 min.

Les liposomes ont été préparés comme décrit ci-dessus, sauf que le colorant fluorescent n'a pas été utilisé. Les liposomes ont été incubés avec des protéines GSDMB/D en/sans la présence d'IpaH7.8 à divers rapports molaires avec ou sans enzymes activatrices. Les mélanges ont été incubés pendant 30 min à 4 °C avant sédimentation à 20 000 g pendant 30 min à 4 °C. Les surnageants ont été transférés immédiatement dans de nouveaux tubes et les culots ont été lavés deux fois avec du tampon B, puis remis en suspension dans un volume égal de tampon. Les protéines des culots et du surnageant ont ensuite été analysées par coloration au bleu de Coomassie de SDS – PAGE.

Les concentrations de protéines de GSDM non marqués et d'IpaH7.8 ont été mesurées en triple à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis à microvolume NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific) en fonction de leurs coefficients d'extinction. Les mesures de calorimétrie de titrage isotherme ont été effectuées à 20 ° C à l'aide d'un microcalorimètre VP-ITC (MicroCal). Les expériences ont été réalisées par l'injection de 250 μl de solution IpaH7.8 (200 μM) dans une cellule d'échantillon contenant 2 ml de GSDMB (10 μM) dans 25 mM de Tris-HCl pH 8,0 et 150 mM de NaCl. Au total, 25 injections ont été administrées à 300 s d'intervalle. En ce qui concerne le GSDMD humain (hGSDMD) et le GSDMD de souris (mGSDMD), 250 μl de solution IpaH7.8 (625 μM) ont été titrés dans une cellule d'échantillon contenant 2 ml de hGSDMD (40 μM) ou de mGSDMD (40 μM). Toutes les données ITC ont été analysées à l'aide du logiciel Origin fourni par le fabricant et adaptées à un modèle de liaison à un site.

Les cellules 293T ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection et ont été fréquemment vérifiées en ce qui concerne leurs caractéristiques morphologiques et leurs fonctionnalités. Les cellules ont été cultivées dans du DMEM (Gibco) additionné de 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (Gibco) et de 2 mM de l-glutamine à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. La transfection transitoire dans des cellules 293T a été réalisée en utilisant de la Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) en suivant les instructions du fabricant.

Pour la détection de l'ubiquitination de GSDMB dans les cellules, pcDNA-FLAG-GSDMB (isoforme 1) a été cotransfecté avec pCMV-HA-IpaH7.8 (WT ou mutants indiqués) dans des cellules HEK293T dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm. Huit heures après la transfection, une concentration finale de 10 μM de bortézomib (Sigma Aldrich) a été ajoutée à la culture cellulaire pour réduire la dégradation des protéines médiée par le protéasome. Après 8 heures supplémentaires, les cellules ont été collectées et lysées dans du Tris-HCl 25 mM pH 7, 5, du NaCl 150 mM, du NP-40 à 0, 5% et un cocktail d'inhibiteurs de protéase 1 × (Sigma Aldrich). Le lysat a été ajouté à 25 μl de billes magnétiques Anti-FLAG M2 (Sigma Aldrich, n° M8823) et incubé à 4 ° C pendant 3 h avec une rotation douce. Les billes ont été lavées trois fois avec du tampon PBS puis éluées avec 50 µl de tampon PBS contenant 100 µg ml–1 peptide FLAG (Sigma Aldrich, n° F3290). Les échantillons élués ont été bouillis avec un volume égal de tampon de chargement SDS 2 × (Bio-Rad) puis traités pour l'immunotransfert avec l'un des anticorps suivants : anti-FLAG (Sigma Aldrich, n° F1804, 1:1 000), anti-actine ( Cell Signaling Technology, n° 3700S, 1:1 000), anti-HA (Cell Signaling Technology, n° 3724S, 1:1 000) ou anti-ubiquitine (Thermo Fisher Scientific, n° PA3-16717, 1:1 000).

Un chacun des plasmides pcDNA-FLAG-GSDMB et pcDNA-FLAG-GSDMD (250 ng) (WT ou mutants indiqués) a été cotransfecté avec 500 ng du plasmide pCMV-HA-IpaH7.8 dans des cellules HEK293T ensemencées dans une plaque à 12 puits à 1,5 × 105 cellules par puits. Après 40 h, les cellules ont été lysées dans un tampon RIPA (Thermo Fisher Scientific), ajoutées à un volume égal de tampon de chargement SDS 2 × (Bio-Rad) et traitées pour immunotransfert.

La mort cellulaire a été déterminée par test de double coloration Hoechst/PI : 150 ng de la construction pcDNA-FLAG-GSDMB indiquée ou 75 ng du plasmide pcDNA-FLAG-GSDMD (FL, NT ou mutants indiqués) ont été transfectés dans des cellules HEK293T ensemencées dans un Plaque 96 puits à 2 × 104 cellules par puits. Pour l'inhibition d'IpaH7.8, pcDNA-FLAG-GSDMB-NT (isoforme 4) a été cotransfecté avec 200 ng du plasmide pCMV-HA-IpaH7.8 (WT ou C357A). Les cellules transfectées ont ensuite été cultivées jusqu'à 40 h. Au début de l'essai, les cellules ont été colorées avec 30 μM PI (Sigma Aldrich) pendant 10 min suivi de 15 μM Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific) pendant 15 min à 37 ° C dans l'obscurité. Ensuite, les cellules ont été visualisées à l'aide d'un ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad). La mort cellulaire a été quantifiée et exprimée en pourcentage de cellules PI-positives parmi les cellules totales (cellules colorées par Hoechst).

Escherichia coli DH5α a été cultivé pendant une nuit dans du milieu BHI, puis dilué le lendemain à 1:100 dans du BHI et cultivé pendant 2 h supplémentaires à 37 ° C jusqu'à la phase exponentielle. Ensuite, 1 ml de la culture bactérienne a été recueilli par centrifugation à 5 000 g pendant 2 min et remis en suspension dans le tampon B jusqu'à une densité cellulaire bactérienne finale de 5 × 108 ml–1. Pour le test de destruction, 5 μl de bactéries ont été ajoutés à une réaction de 15 μl contenant 10 μM de GSDMB pleine longueur en l'absence ou en présence de GZMA. Les réactions ont été réalisées à 37 °C pendant 2 h. Après incubation, 5 µl de bactéries traitées ont été ensemencés dans 200 µl de BHI dans des plaques 96 puits à fond plat. La croissance bactérienne a été surveillée en lisant l'absorbance à 600 nm sur 6 h à l'aide d'un lecteur de plaques SpectraMax M5 (Molecular Devices). Le nombre d'unités formant colonies (UFC) récupérées a été calculé en normalisant la DO600 des bactéries traitées (avec GZMA dans les réactions) par rapport aux bactéries non traitées (tampon ou sans GZMA).

L'isoforme 1 de GSDMB purifiée a été ajoutée aux liposomes préparés, suivie de l'ajout de protéase 3C pour initier la formation de pores. La réaction s'est déroulée sur glace pendant 3 h. Les liposomes chargés de pores GSDMB ont été solubilisés par 2% de C12E8 (Anatrace) pour extraire les pores. Pour éliminer les particules au comportement médiocre et le GSDMB-C, les échantillons ont été purifiés davantage à l'aide d'une colonne d'exclusion de taille d'augmentation Superose 6 (10/300) (Cytiva) équilibrée avec du tampon B (25 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl et 0,006% C12E8) .

Pour la coloration négative, 10 μl du complexe GSDMB – IpaH7.8 ou du pore GSDMB ont été appliqués sur une grille de cuivre revêtue de carbone et déchargée (Electron Microscopy Sciences). L'échantillon a été incubé sur la grille pendant 1 min, coloré avec de l'acétate d'uranyle à 1 % pendant 1 min et séché par buvardage. Les grilles ont été imagées sur un microscope électronique à transmission Hitachi H-7650 équipé d'une caméra CCD 2k (Advanced Microscopy Techniques) à l'UCONN Health Electron Microscopy Facility.

Pour le complexe GSDMB – IpaH7.8, 3,5 μl d'échantillon fraîchement purifié à 0,5 mg ml – 1 ont été appliqués sur des grilles de cuivre trouées Quantifoil à décharge luminescente de plasma (R 1,2 / 1,3, 400 mesh, Electron Microscopy Sciences) à l'aide d'un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) réglé à une force de buvardage de 4, un temps de buvardage de 5,5 s, 100 % d'humidité et 4 °C. Les grilles buvées ont été immédiatement plongées dans de l'éthane liquide et transférées dans de l'azote liquide pour stockage. Un ensemble de données cryo-EM a été collecté à l'installation cryo-EM de l'Université Case Western Reserve sur un microscope électronique Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) équipé d'un détecteur d'électrons direct K3 Summit (Gatan) et d'un filtre d'énergie post-colonne (Gatan) dans mode de comptage à l'aide de serialEM. Un total de 3 128 films ont été enregistrés à des valeurs de défocalisation allant de -0,8 à -2,5 μm à un grossissement × 105 000 et une taille de pixel de 0,414 Å. Pour chaque film, 58 images ont été acquises en 5,25 s à une dose totale approximative de 66,95 e− Å–2.

Pour les pores GSDMB, les pores GSDMB solubilisés au détergent ont été concentrés à 0, 6 mg ml – 1 puis congelés sur des grilles de cuivre trouées Quantifoil recouvertes d'un film de carbone ultra-mince (R 1, 2 / 1, 3, 400 mesh, Electron Microscopy Sciences). En bref, une goutte de 3 μl d'échantillon de pores GSDMB a été appliquée sur une grille de carbone en dentelle à décharge luminescente au plasma montée sur un Vitrobot. La grille a ensuite été buvardée avec du papier filtre pendant 6 s à la force de buvardage 10 après un temps d'attente de 2 s. L'humidité et la température dans le Vitrobot ont été réglées à 100 % et 4 °C, respectivement, tout au long de l'opération. La grille buvardée a ensuite été plongée dans de l'éthane liquide et transférée dans de l'azote liquide pour stockage. L'ensemble de données cryo-EM a été collecté dans l'installation cryo-EM de la faculté de médecine Chan de l'Université du Massachusetts sur un microscope électronique Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) équipé d'un détecteur d'électrons direct K3 Summit (Gatan) et d'un filtre d'énergie post-colonne. (Gatan). Au total, 6 376 films ont été collectés en mode comptage, chacun contenant 50 images et une dose d'exposition totale de 50 e–1 Å–2. Le grossissement a été fixé à 105 000, la taille des pixels était de 0,83 Å et la plage de défocalisation de -1,0 à -2,0 μm.

Les films bruts ont été corrigés par référence de gain et pour le mouvement induit par le faisceau et additionnés en images corrigées en mouvement à l'aide de MotionCor2 (réf. 39). Les paramètres CTF ont été déterminés à l'aide de CTFFind4 (réf. 40) et affinés ultérieurement dans cryoSPARC41.

Pour le complexe GSDMB – IpaH7.8, après la sélection des particules à l'aide du modèle général dans crYOLO42, les coordonnées (1 522 742 particules au total) ont été transférées à cryoSPARC pour un traitement ultérieur. Plusieurs cycles de classification 2D ont été effectués pour éliminer la glace, les bords de carbone et les particules faussement positives contenant du bruit. Les classes fréquemment présentées contenant 307 276 particules ont été sélectionnées et soumises à une reconstruction 3D ab initio suivie d'un raffinement hétérogène. La classe optimale, contenant 113 959 particules, a été sélectionnée pour un raffinement homogène et non uniforme43. La résolution de la carte de densité électronique finale a été estimée à 3, 8 Å, sur la base du critère de corrélation de coquille de Fourier (FSC) de référence de 0, 143 (réf. 44). La distribution de la résolution locale de la carte a été déterminée par ResMap45. La carte de densité affinée dans cryoSPARC a été utilisée pour produire des figures.

Pour les pores GSDMB, un total de 692 212 particules ont été initialement extraites par prélèvement manuel et automatisé de particules dans cryoSPARC. Une classification bidimensionnelle a été effectuée dans cryoSPARC pour éliminer la glace, les bords de carbone et les particules faussement positives contenant du bruit. Après la classification 2D, 156 037 particules ont été importées dans Relion-4.0 pour une classification 3D avec un modèle initial généré de novo dans cryoSPARC en utilisant le même ensemble de particules. La symétrie C1 a été utilisée pour le premier cycle de classification 3D ; Des classes 3D avec des caractéristiques relativement claires de symétrie C24 ont été sélectionnées pour un cycle supplémentaire de classification 3D avec une symétrie C24 afin d'éliminer les mauvaises particules. Ensuite, 41 799 particules de la classe 3D avec une résolution optimale ont été réimportées dans cryoSPARC pour un raffinement non uniforme. Avec la symétrie C24, la résolution de la carte des pores GSDMB était de 4, 96 Å, mesurée par l'étalon-or FSC de 0, 143. Le raffinement de la mise au point avec un masque excluant la région du tonneau β a amélioré la résolution locale du domaine globulaire GSDMB à 4, 48 Å.

Des modèles atomiques du complexe IpaH7.8 – GSDMB et du pore GSDMB ont été construits et affinés en densité cryo-EM à l'aide de Coot46 et PHENIX47. Pour le complexe IpaH7.8 – GSDMB, les structures prédites par AlphaFold2 de IpaH7.8 et GSDMB ont été utilisées comme modèles de départ27. Les modèles d'IpaH7.8 et de GSDMB ont été ancrés dans la densité EM en tant que corps rigide dans UCSF Chimera48, puis ajustés manuellement dans Coot. Le modèle structurel du complexe a été affiné à l'aide de 'phenix.real_space_refine', avec des contraintes de structure secondaire et Coot de manière itérative. La qualité du modèle atomique a été évaluée par Molprobity49. Pour les pores GSDMB, la structure de GSDMB dans le complexe IpaH7.8 – GSDMB a été utilisée comme modèle de départ. Une procédure similaire a ensuite été effectuée pour un ajustement et un raffinement supplémentaires. Les figures ont été préparées en utilisant PyMOL (Schrödinger) et UCSF Chimera.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les coordonnées atomiques du complexe GSDMB – IpaH7.8, des pores GSDMB et des pores GSDMB sans le barillet β ont été déposées dans la Protein Data Bank (PDB) sous les numéros d'accès. 8EFP, 8ET2 et 8ET1, respectivement. Les cartes de densité cryo-EM associées ont été déposées dans la banque de données de microscopie électronique sous les numéros d'accès. EMD-28087, EMD-28584 et EMD-28583, respectivement. Toutes les autres données sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Plusieurs coordonnées structurelles dans la base de données PDB utilisée dans cette étude peuvent être localisées par les numéros d'accès. 6CB8, 5B5R, 6N9O, 6N9N, 6VFE, 7V8H et 3CVR.

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Nous remercions S. Dou (QuintaraCT, Inc.), X. Li et Y. Wang pour les discussions. Ce travail a été soutenu par le UConn Health Start-up Fund et les National Institutes of Health des États-Unis (numéros de subvention R01AI158435 à JR et R01AI119015 à VAR).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Sonia Shivcharan, Tian Tian, ​​Skylar Wright

Département d'immunologie, École de médecine, Centre de santé de l'Université du Connecticut, Farmington, CT, États-Unis

Chengliang Wang, Sonia Shivcharan, Tian Tian, ​​Skylar Wright, Danyang Ma, Vijay A. Rathinam et Jianbin Ruan

Département de biochimie et de biotechnologie moléculaire et installation centrale de cryo-microscopie électronique, Université du Massachusetts Chan Medical School, Worcester, MA, États-Unis

JengYih Chang, Kangkang Song et Chen Xu

Noyau de cryo-microscopie électronique, École de médecine de l'Université Case Western Reserve, Cleveland, OH, États-Unis

Kunpeng Li

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JR et CW ont conçu l'étude. CW, TT et DM ont exprimé et purifié des protéines. Pores GSDMB reconstitués CW. Grilles criblées CW et données cryo-EM collectées, assistées par JC, KL, KS et CXCW et JR ont déterminé les structures cryo-EM. CW et JR ont effectué des expériences biochimiques. SS, TT, SW et CW ont réalisé des expériences cellulaires. JR et VAR ont supervisé le projet. Tous les auteurs ont organisé et analysé les données. JR et CW ont rédigé l'article, avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Jianbin Ruan.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Profil de filtration sur gel et SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie du complexe GSDMB-IpaH7.8. Résultats représentatifs de plus de 3 expériences indépendantes. b, Un bref organigramme de la collecte et du processus de données cryo-EM à une seule particule. c, carte Cryo-EM (panneau supérieur) et estimation de la résolution locale (panneau inférieur) du complexe GSDMB-IpaH7.8 calculée à l'aide de ResMap. La résolution la plus élevée est observée au niveau du domaine IpaH7.8-LRR et du domaine GSDMB-N. GSDMB-C présente une résolution relativement faible. d, La courbe de corrélation de coquille de Fourier (FSC) de référence pour la carte globale et les corrélations modèle à carte du complexe GSDMB-IpaH7.8.

a, Comparaison structurelle de GSDMB-C dans le complexe IpaH7.8-GSDMB et la structure cristalline rapportée (PDB : 5TJ2). Les couleurs passent du bleu à l'extrémité N au rouge à l'extrémité C. b, alignement de séquence basé sur la structure des GSDM humains et des GSDMD de souris. Les structures cristallines précédemment rapportées de hGSDMD (PDB : 6N9O) et de mGSDMD (PDB : 6N9N) et les structures prédites par AlphaFold2 de GSDMA humain (hGSDMA), de GSDMC humain (hGSDMC) et de GSDME humain (hGSDME) sont alignées sur GSDMB à l'aide de PROMALS3D. Les éléments structurels secondaires de GSDMB sont indiqués au-dessus de la séquence. Le lieur interdomaine et le sous-domaine C-terminal sont également indiqués. Les deux éléments structurels interagissant avec IpaH7.8 sont marqués respectivement par des cases rouges et vertes. Les trois résidus chargés négativement dans la boucle α1-β' sont indiqués par des points rouges, et l'insertion d'arginine (mR20) dans le GSDMD de souris est indiquée par un triangle bleu.

a, Une vue rapprochée du patch d'interaction I dans le complexe GSDMB-IpaH7.8. GSDMB est représenté sous la forme d'un diagramme en ruban. Deux résidus chargés négativement sont représentés sous forme de bâtonnets. IpaH7.8 est représenté sous forme de potentiels électrostatiques. La distance entre les deux petites poches basiques formées par R186 et H209 et les résidus environnants dans IpaH7.8 est étiquetée. b, Alignement de séquences des domaines LRR de Shigella IpaHs. Les éléments structuraux secondaires sont indiqués au-dessus de la séquence. Les résidus universellement conservés sont marqués d'une teinte rouge et les résidus partiellement conservés sont colorés en rouge. Les résidus impliqués dans Interface Patch II et I sont indiqués par des points rouges et des triangles verts, respectivement. c, Immunoblots de cellules 293T co-transfectées avec GSDMB marqué FLAG et HA-IpaH7.8 (WT ou mutants indiqués). Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes.

a—c, mesure basée sur l'ITC des affinités de liaison d'IpaH7.8 avec GSDMB (a), humain (hGSDMD) (b) et GSDMD de souris (mGSDMD) (c), respectivement. Kd, constante de dissociation ; N, la stoechiométrie du complexe. DP, puissance différentielle mesurée par la machine ITC ; ΔH, changement de chaleur mesuré par la machine ITC. La moyenne ± SD est indiquée (n = 3). d—f, profils de filtration sur gel et SDS-PAGE colorés au bleu de Coomassie d'IpaH7.8 incubés avec GSDMB (d), GSDMD humain (hGSDMD) (e) ou GSDMD de souris (mGSDMD) (f). Résultats représentatifs de plus de 3 expériences indépendantes. g, h, profils de filtration sur gel IpaH7.8 incubés avec des mutants GSDMB- (g) ou humains GSDMD-D17S/R20Ins (h), respectivement. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes. i, Une vue rapprochée de l'interface entre IpaH7.8 et GSDM. Les structures de GSDMA humain (hGSDMA ; AlphaFold2 prédit), de GSDMC humain (hGSDMC ; AlphaFold2 prédit), de GSDMD humain (PDB : 6N9O), de GSDME humain (hGSDME ; AlphaFold2 prédit) et de souris GSDMD (PDB : 6N9N) sont superposées sur GSDMB dans la structure du complexe GSDMB-IpaH7.8. Les séquences d'acides aminés du brin ß3 interagissant avec IpaH7.8 de chaque GSDM sont présentées. j, SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie de l'ubiquitination in vitro de GSDMD humain et murin (WT et mutants indiqués). mβ3, remplace le brin β3 dans le GSDMD humain par la séquence de souris correspondante. GSDMBβ3, remplace le brin β3 dans le GSDMD de souris par la séquence GSDMB correspondante. Les mutations n'ont pas modifié l'ubiquitination in vitro. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes.

a, les profils de filtration sur gel n'indiquent aucune interaction entre GSDMB et le mutant IpaH7.8-Y165E/Y166E ou le mutant IpaH7.8-R186E/R228D. Résultats représentatifs de plus de 3 expériences indépendantes. b, La capacité de GSDMB à induire une fuite de liposomes lorsqu'il est incubé avec IpaH7.8 (WT) à différentes doses. Chaque point représente la moyenne ± SD de 3 répétitions techniques. c, association de GSDMB avec des CL-liposomes en présence d'IpaH7.8 dans un test de sédimentation de liposomes. FL : pleine longueur ; N : domaine N-terminal ; et C : domaine C-terminal. Les SDS-PAGE ont été colorées au bleu de Coomassie. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes. d, La capacité du GSDMD humain à induire une fuite de liposomes de CL-liposomes en présence d'IpaH7.8 à différentes doses. Chaque point représente la moyenne ± SD de 3 répétitions techniques. e, test de sédimentation des liposomes montrant l'association de GSDMD humain avec des liposomes CL en présence d'IpaH7.8. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes. f, les essais de sédimentation des liposomes montrent l'association de GSDMD humain ubiquitiné ou non ubiquitiné avec des liposomes CL. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes. g, les essais de fuite de liposomes montrent l'effet de l'ubiquitination dans l'inhibition des activités de formation de pores du GSDMD humain. Les données ont été normalisées avec la fluorescence observée après l'ajout de détergent et la mise à zéro de la fluorescence juste avant l'ajout de protéines. Chaque point représente la moyenne ± SD de 3 répétitions techniques. h, Ubiquitination in vitro de mutants GSDMB avec des lysines mutées en arginines. 3R, avec K177, K192 et K192 mutés en arginines dans GSDMB. Les SDS-PAGE ont été colorées au bleu de Coomassie. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes.

Les éléments structurels secondaires du GSDMB et du GSDMD humain (PDB : 6VFE) sont indiqués respectivement au-dessus et au-dessous de la séquence. Les deux épingles à cheveux transmembranaires sont mises en évidence dans des cases orange. Toutes les lysines du GSDMB et du GSDMD humain sont colorées en bleu. Les lysines supposées être impliquées dans la formation des pores et criblées pour l'ubiquitination dans notre étude sont mises en évidence dans les cases bleues. La séquence "canonique" dans le lieur interdomaine GSDMB est mise en surbrillance dans une boîte verte. Les résidus dans le lieur interdomaine qui peuvent médier l'oligomérisation des pores et la liaison des lipides sont mis en évidence dans les cases en pointillés rouges et sur fond bleu, respectivement.

a, Ubiquitination in vitro des isoformes de GSDMB par Shigella IpaH7.8. Les réactions d'ubiquitination terminées à 0 min par ébullition avec un tampon de chargement SDS-PAGE ont été utilisées comme témoins négatifs non ubiquitinés. SDS-PAGE a été coloré avec du bleu de Coomassie. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes. b, effet de l'ubiquitination sur l'inhibition des activités de formation de pores de l'isoforme 6 de GSDMB montré par un test de fuite de liposomes utilisant des CL-liposomes. Chaque point représente la moyenne ± SD de 3 répétitions techniques. c, Clivage des isoformes de GSDMB par GZMA. 3,6 μg d'isoformes de GSDMB ont été incubés avec 1 μg de GZMA, respectivement. Le clivage a été réalisé en incubant le mélange à 37°C pendant 2 heures. Blanc * indique le GSDMB-NT. Le poids moléculaire du GSDMB-NT de l'isoforme 2 (25,9 kDa) est très proche du GZMA (25,8 kDa) et ne peut pas être séparé sur SDS-PAGE. SDS-PAGE a été coloré avec du bleu de Coomassie. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes. d, Effet des isoformes GSDMB dans l'induction de la pyroptose dans les cellules HEK293T. FL : GSDMB pleine longueur ; NT : domaine N-terminal de GSDMB. La barre d'échelle est de 100 μm. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes. e, Effet d'IpaH7.8 sur l'inhibition de la mort cellulaire pyroptotique médiée par l'isoforme GSDMB 4 des cellules HEK293T. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes. La barre d'échelle est de 100 μm. f, Quantification de la mort cellulaire en (e). Barres d'erreur, moyenne ± SD de 3 expériences indépendantes. ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Tukey par rapport au contrôle des cellules HEK293T transfectées avec des plasmides de GSDMB-NT et un vecteur vide. ** p < 0,005. g, Effet des isoformes de GSDMB sur l'inhibition de la croissance bactérienne. Barres d'erreur, moyenne ± SD de 3 expériences indépendantes. ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Tukey avec des échantillons comparés à leurs témoins non clivés. *, p < 0,1, ***, p < 0,001, NS : non significatif.

a, Images négatives représentatives de coloration électromagnétique des pores des isoformes 4 et 6 de GSDMB extraites de cardiolipine-liposomes à l'aide d'un détergent C12E8. Barre d'échelle : 50 nm. Résultats représentatifs de plus de 3 expériences indépendantes. b, une image négative représentative des pores de l'isoforme 1 du GSDMB solubilisés dans du C12E8 (panneau de gauche) et une image cryo-EM des pores de l'isoforme 1 du GSDMB collectés sur un microscope Titan Krios équipé d'une caméra K3. Résultats représentatifs de plus de 3 expériences indépendantes. Barre d'échelle : 50 nm. c, Un bref organigramme de la collecte de données cryo-EM à une seule particule et du processus de l'ensemble de données de pores GSDMB. d, la courbe de corrélation de coquille de Fourier étalon-or pour les corrélations de demi-carte du pore GSDMB.

a, La courbe FSC étalon-or pour le prépore GSDMB. b, La carte cryo-EM (à gauche) et la carte cryo-EM équipée d'un modèle atomique (à droite) du prépore GSDMB 24 fois. Les protomères GSDMB sont colorés différemment. Le prépore GSDMB n'a pas de région d'insertion transmembranaire. Les cases en pointillés rouges indiquaient la région transmembranaire manquante. c, formation en épingle à cheveux β (HP) des pores GSDMB. La région β3-β5 du premier domaine d'extension (ED1) se transforme en HP1. La région β7-α4-β8 représente ED2 et se transforme en HP2. d, Deux sous-unités voisines dans le pore GSDMB. Les éléments structuraux qui participent à l'oligomérisation sont marqués et colorés en jaune. e, f, les densités Cryo-EM du lieur interdomaine dans le pore hGSDMD (e) et le pore GSDMB (f) sont indiquées, respectivement. Les densités globales sont colorées en gris avec les densités des lieurs interdomaines dans les pores hGSDMD et GSDMB colorées en rose et magenta, respectivement. Les lieurs interdomaines sont colorés en rouge. g, Une vue rapprochée de la région 1 du lieur interdomaine dans l'isoforme GSDMB 1. L'hélice α3' forme la sous-unité voisine interagissant avec le lieur interdomaine est colorée en jaune. h, effet de la mutation de la région 1 dans le lieur interdomaine des isoformes 1 et 4 de GSDMB dans l'induction d'une fuite de liposomes (10 % PS). Chaque point représente la moyenne ± SD de 3 répétitions techniques. WT : GSDMB de type sauvage ; Région 1 : mutation du motif Région 1 en "GGGG" dans GSDMB. i, j, les cellules HEK293T ont été transfectées de manière transitoire avec les constructions indiquées de GSDMB isoforme 4 (i) et hGSDMD (j) pendant 24 h et colorées avec Hoechst 33342 et PI. FL : pleine longueur ; NTWT : GSDMB/D-NT de type sauvage ; NTBS4 : GSDMB/D-NT hébergeant une triple mutation des trois résidus basiques dans GSDMB isoforme 4 et dans hGSDMD en acides glutamiques dans BS4. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes. La barre d'échelle est de 100 μm.

Ce fichier contient les immunoblots non recadrés (Figs. 1 et 2 supplémentaires).

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Réimpressions et autorisations

Wang, C., Shivcharan, S., Tian, ​​T. et al. Base structurelle pour la formation de pores GSDMB et son ciblage par IpaH7.8. Nature 616, 590-597 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05832-z

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Reçu : 18 octobre 2022

Accepté : 13 février 2023

Publié: 29 mars 2023

Date d'émission : 20 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-05832-z

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Mort cellulaire et différenciation (2023)

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